SUMO论文：鼠胚胎干细胞中SUMO修饰对Nanog调控作用研究.docVIP

SUMO论文：小鼠胚胎干细胞中SUMO修饰对Nanog调控作用研究 【中文摘要】SUMO修饰是真核细胞内广泛存在的一种翻译后修饰途径,调节细胞内多种蛋白的功能、稳定性和亚细胞定位。Nanog基因是维持胚胎干细胞多能性和自我更新的关键基因,为了阐明SUMO修饰对Nanog基因的调控作用,本研究以F9畸胎瘤细胞为模型,利用实时定量PCR(Real time PCR)、免疫印迹(Western blot)、双荧光素酶报告基因分析(Dual-Luciferase Reporter assay)、免疫荧光染色等方法,从不同角度研究了SUMO修饰对Nanog基因的影响。实验结果如下:1.利用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR,OE PCR)方法,克隆小鼠Nanog基因启动子区-230—+50bp序列和Oct4/Sox2元件突变的序列,分别将野生型和突变体启动子片段插入荧光素酶报告基因载体pGL4.10中,构建Nanog启动子荧光素酶报告基因载体pGL4-230 luc,pGL4-230 Soxmut luc,pGL4-230 Octmut luc和pGL4-230 Octm/Soxm luc。测序结果证明构建的载体序列与预期结果一致。用上述载体分别转染多能性的F9畸胎瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3,双荧光素酶报告基因分析检测启动子活性。结果表明,本实验中克隆到的启动子片段为Nanog有效启动子,能有效启动下游基因的转录并具有组织特异性。2.本研究证明了SUMO修饰抑制Nanog表达。一方面通过RNAi敲降SUMO1和Ubc9,另一方面过表达SUMO1和Ubc9,F9细胞内蛋白整体SUMO修饰水平呈现出差异。利用实时定量PCR、免疫印迹、双荧光素酶报告基因分析检测不同SUMO修饰水平下Nanog转录水平、翻译水平的变化。结果发现细胞处于高度SUMO修饰状态时,Nanog表达水平低;相反,低SUMO修饰状态的F9细胞Nanog表达水平升高,表明SUMO修饰抑制Nanog表达。3.分别使用野生型Oct4、SUMO修饰位点突变体Oct4 K118R真核表达载体与SUMO修饰系统组分SUMO1和Ubc9表达载体共转染F9细胞,检测Nanog转录水平和翻译水平的差异,结果表明SUMO修饰Oct4促进Nanog表达。采用相同的方法研究SUMO修饰Sox2对Nanog表达的影响,即用野生型pCMV-HA-Sox2、SUMO修饰位点突变体pCMV-HA-Sox2 K247R与SUMO修饰系统组分SUMO1和Ubc9表达载体共转染F9细胞,实时定量PCR、免疫印迹、双荧光素酶报告基因分析检测在不同SUMO修饰状态的Sox2细胞中Nanog表达量的变化。实验结果表明:与Oct4相反,SUMO修饰Sox2抑制Nanog表达。4.SUMO常通过影响蛋白质的亚细胞定位、改变蛋白质分子间相互作用界面来调节底物蛋白的功能。为进一步阐明SUMO修饰抑制Nanog表达的分子机理,本实验利用红色荧光蛋白报告基因载体和免疫荧光染色等方法研究SUMO修饰对Oct4和Sox2亚细胞分布情况的影响。即用pDSRed-Oct4、pDSRed-Oct4 K118R和pCMV-HA-SUMO1、pCMV-HA-Ubc9共转染F9细胞,荧光显微镜下观察野生型Oct4和不能被SUMO修饰的Oct4 K118R在细胞中的分布,结果发现Oct4和Oct4 K118R都定位在细胞核中,SUMO修饰不影响Oct4在F9细胞中的分布。野生型pCMV-HA-Sox2和SUMO修饰突变体载体pCMV- HA-Sox2 K247R与pCMV-HA-SUMO1、pCMV-HA-Ubc9共转染F9细胞后,免疫荧光染色检测Sox2和Sox2 K247R的亚细胞定位。结果表明SUMO修饰未改变Sox2的亚细胞定位,Sox2和Sox2 K247R一样,都定位在细胞核中。 【英文摘要】SUMOylation is a critical and ubiquitous post-translation modification pathway in eukaryocytes, SUMOylation modulates proteins’subcellular location, stability and interaction. Nanog is an embryonic specific“master gene”found in 2003, it is very important to maintaining the pluripotency of embryonic stem cells. In order to elucidate the effect of SUMOylati