2015年秋季生物化学B实验-实验要求概论.docVIP

2015年秋季“生物化学实验B课 序 号：?1010430050和?1010430051 实验地点：生命学院楼321 上课时间：上午8:00开始全天 任课教师： 李晓晖lxhxh@， 座机电话号码 陈丽杰：ljchen@， 座机电话号码 戴建英：jydai@， 座机电话号码 孙亚琴：sunyaqin@， 座机电话号码 李 宁：liningqyq@， 一、实验内容： 1. 实验4、实验5、实验6（见教科书附录 生物化学实验） 2. 预习并掌握：实验目的及原理、仪器和试剂、实验操作步骤 3. 预习报告：根据实验4，推导酶活计算公式，表明各参数单位。（注：书上公式不完整）。碱性磷酸酶酶活定义：在37℃条件下，以每分钟催化水解1 μmol底物的酶量为一个酶活力单位。 小牛肠碱性磷酸酶分子量为145000，等电点为5.7。碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠，使之水解释放出对硝基苯酚，后者在405 nm光波长下有最大吸收。通过测定吸光值的变化率，可测知对硝基苯酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。 A/min ：405 nm波长下的吸光值的变化率；VR：反应液的体积，mL；D：稀释倍数； E405：405 nm波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数，18.3 L/ molcm ； VE：所加酶液体积，mL；C：蛋白的原始浓度，mg/mL；L：比色皿光程，0.5 cm。U/mg） 二、实验注意事项： 1、有机溶剂、考马斯亮蓝染色液等倒入相应的废液瓶中； 2、滤布洗干净回收3、清洗使用过的仪器； 4、实验台按要求摆放整齐； 5、。 三、实验纪律： 1、按时上课 2、穿实验服（白大衣） 3、不许吃东西，不许打闹跑步不许大声喧哗 4、女学生要穿平跟鞋，长头发要束起 5、手机静音 四、实验报告书写要求： 由传统的实验报告改为研究论文模式书写并提交在得到实验数据后，学会分析、归纳、总结并提出自己的见解，提高学生针对某一问题的全面思考能力，利用已有理论知识达到创新意识培养目的，全面提高学生综合素质，为今后从事科研工作奠定基础。1. 封面： 2. 实验报告：以研究论文模式写作（高等学校化学学报稿件模板） 3. 实验报告：A4纸，打印。 4. 实验报告提交：1周后交，周下午生化楼317李宁老师 五、实验成绩： 1预习：0分 2. 操作：分3. 实验报告：0分1. 生物化学实验课前一定要认真预习，真正领会实验原理和操作步骤，了解所用实验仪器、试剂的特殊性，才能如期完成实验内容。 2. 需要组内成员团结协作，默契配合才能很好地完成实验。 3. 带一个干净容器，用于装实验的凝胶（大约10 cm长，6 cm宽）和洗脱液。因实验时间短，染色的凝胶未完全脱色，需要带回去继续脱色，直到样品条带清晰，利于拍照为止。 4. 按照自己的实验内容和得到的数据进行分析讨论，独立完成实验报告！！！ 5. 禁止复制粘贴，禁止相互抄袭！如报告相同，二份都为不及格！！！ 6. 如果已安排的时间不能上课，请同学自己找其他同学调课；也可以根据教学纪录表中空余时间安排实验，并将上课时间通知任课教师。 关键词 小牛肠碱性磷酸酶提取；酶活测定；考马斯亮蓝法；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 碱性磷酸酶（ ALP 或 AKP ）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5，-磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5，-P末端转换成5，-OH末端。测定ALP对于骨骼、肝、胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸的鉴别诊断有重要意义。本实验以小牛肠为原料，分离纯化小牛肠碱性磷酸酶并研究酶活。首先通过对牛小肠内膜的刮取、离心、沉淀析出等方法，提取牛小肠碱性磷酸酶。然后用考马斯亮蓝G-250与碱性磷酸酶结合，利用在一定蛋白浓度范围内（0.01～1.0mg/ml）,此结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比的关系测定蛋白质含量。考马斯亮蓝法用于测定蛋白质的含量，反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，是一种常用的蛋白质快速微量测定法。同时本实验通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，分析所获得的电泳结果来推算出被测蛋白质分子量的近似值。此方法具有操作简单、样品用量少、一般不引起生物活性物质变化的优点 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 Centrifuge 5804R型离心机（德国艾本德股份公司），UV762型紫外/可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），HWS-12电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），WD-9405A脱色摇床（沃德生物医学仪器公司），DYY-2C型电泳仪（北京六一仪器厂），匀浆机，离心管，剪刀，载玻片，不锈钢盘，搪瓷盘，滤布，漏斗，分液漏斗，量筒，烧杯，移液枪，比色皿，分析天