13级第六章酶精读.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 酶的固定化方法很多，通常按照酶与载体结合的化学反应的类型进行分类。 各种方法也各自具有自身的优缺点 表6-4 。 * * 固定化方法 非共价结合法 化学结合法 包埋法 结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 交联法 共价结合法 微囊法 网格法 * * 表6-4 酶固定化方法的优缺点 特 性 物理吸附法 离子结合法 包埋法 共价结合法 交联法 制 备 易 易 易 难 难 结合力 中 弱 强 强 强 酶活力 高 高 高 中 中 底物专一性 无变化 无变化 无变化 有变化 有变化 再生 可能 可能 不可能 不可能 不可能 费用 低 低 中 中 高 * * （二）固定化酶的性质 ①固定化后酶活力和稳定性的变化 固定化酶活力在大多数情况下比天然酶小，其专一性也可能发生变化； 大多数情况下酶固定化后其稳定性都有不同程度增加； 酶固定化后也可能使最适反应pH的范围改变； 酶固定化后其活力可缓慢释放，因此使酶的稳定性比天然状态高。 第三节 第六章 酶 * * ②固定化酶最适条件的变化 酶固定化后由于热稳定性提高，因而最适反应温度发生变化，一般比固定以前提高。但也有少数报道例外。 酶固定化时，其最适pH变化可达1～2个pH单位，而且酶活力-pH曲线也会发生一定的偏移，一般不再是钟形曲线。 * * ③固定化酶对米氏常数的影响 随载体的带电性能而变化。当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制效应，可造成上升。 * * 固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例，然而，真正投入食品工业化应用的固定化酶却并不多，原因是固定化使用的试剂和载体成本高、固定化效率低、稳定性差、连续操作使用的设备比较复杂。因此，目前仅有少数固定化酶被应用于工业化。 第三节 第六章 酶 三 固定化酶的应用 * * 三 固定化酶的应用 固定化葡萄糖异构酶，生产高果糖浆。 葡萄糖异构酶的菌种: 链霉菌、凝结芽孢杆菌、放线菌、节杆菌。 载体: DEAE-纤维素、多孔陶瓷，后一种已用于大规模的柱状反应器中生产高果糖浆。 第三节 第六章 酶 * * 其它固定化酶： 氨基酰基转移酶、天冬酶 、富马酸酶 半乳糖苷酶：水解棉子糖（甜菜汁中阻碍蔗糖结晶） 乳糖酶：水解乳糖（乳糖不耐症） 固定化微生物细胞：固定化微生物应用于废水处理 。 应用于食品分析：酶电极 第三节 第六章 酶 * * 可用于测定食品成分、食品酶活力和食品中酶的抑制剂，通常无需将待测物和其他组分分离。 固定化酶在食品分析中使用的有固定化酶柱、酶电极、含酶的薄片和酶联免疫分析（ELISA 酶法分析中最好选择分光光度法和电化学方法测定反应物和底物。 也可采用复合酶分析。 第六节 第六章 酶 6.6 酶法分析 * * 一、酶法测定底物的含量 当被测化合物是酶的底物时，根据底物消耗的情况，可以分别采用终点测定法和动力学的方法。 * * （1）终点测定法 适用条件：反应必须进行完全 方法：从反应前后酶反应体系的吸光度或荧光的总变化测定产物（或底物）的量 优点：不需要精确控制酶反应条件 缺点：需要使用较多的酶 图6-4 底物浓度对吸光度的影响 * * （2）动力学方法 n适用条件：待测物的浓度必须小于100Km（最好小于5Km） 计算方法：根据米氏方程。 关键：严格控制酶反应的条件，制作线性关系良好的标准曲线。 第六节 第六章 酶 * * 二、酶法测定激活剂或抑制剂含量 激活剂（辅酶）浓度与酶促反应速度V之间的关系： kd k1,s k2 E+Act E·Act E·Act·S E·Act +P k-1 激活剂反映初速度增加时，可根据增加的程度测定该化合物的浓度。 第六节 第六章 酶 * * [Act]-Vo可能存在两种关系： 激活剂与酶牢固结合，kd小于10-9 mol/L,则呈线性关系 激活剂与酶松散结合（kd大于10-8 mol/L），其测定类似于酶底物浓度的测定。 第六节 第六章 酶 * * 三、测定食品热烫和灭菌效果的指示酶 指示热处理是否充分的酶： 过氧化物酶作为果蔬热处理指标； 碱性磷酸酶活力作为牛奶制品和火腿的热处理指标 检测食品原料是否经受冷冻和解冻 苹果酸酶和谷氨酸草