粉蕉枯萎病拮抗细菌菌筛选.docVIP

粉蕉枯萎病拮抗内生细菌菌筛选 1材料 1.1供试菌 香蕉枯萎病菌生理小种4号 Fusarium oxysporum f. sp.cubense race four ，由中国热带农业科学院提供。 1.2香蕉植株 粉蕉 Musa paradisica 品种为广粉1号，由海南省澄迈县海口润之达香蕉技术产业有限公司 1.3消毒试剂 0.1%的升汞，75%的酒精，无菌水。 1.4培养基 （1）NA培养基： 牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂18g蒸馏水1L，pH 7.0。 （2）牛肉膏蛋白胨培养基： 琼脂20g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0-7.2。 （3）PDA培养基： 马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000mL。 2方法 2.1香蕉枯萎病拮抗细菌菌的分离 2.1.1拮抗香蕉枯萎病植株内生细菌菌的分离 将香蕉杆横切，取香蕉杆中心组织块（J），用剪刀剪成2 cm长的小块；挖取香蕉根，将其分为根基（GD）及根尖（GJ）两部分，用无菌水冲洗干净。把材料置于75%乙醇消毒5s，而后用0.1%的升汞消毒3 min，再用无菌水冲洗3次。用灭菌的滤纸吸干水分，加lmL无菌水于灭菌研钵中研磨成匀浆，记为梯度l。移取研磨液采用系列浓度梯度稀释法进行稀释（10-1），取每个稀释度的菌液200μL均匀地涂布于倒有NA培养基上，倒置于 30℃恒温培养箱中培养3-7 天。每个梯度4个重复，同时以最后一次洗涤的水作为对照。 实验仪器：1、灭菌：培养皿、滤纸、试管、研钵、无菌水、移液枪枪头、 2.1.2土壤拮抗细菌的分离 取采集的香蕉根际土10g，倾入装有90mL灭菌水的250mL三角瓶中，混匀后制成悬浮液，于28℃条件下，180 r/min 摇床中振荡 30min，然后静止10 min，吸取上清液1mL，采用10倍稀释法，将其稀释成10-1浓度的混悬液。取稀释好的各浓度的混悬液各200μL，涂布于NA培养基平板中，倒置于30℃恒温培养箱中培养，每个梯度重复4次。随时观察菌体的生长情况，并进行记录。适时挑取不同形态的菌落进行划线纯化。然后挑取不同形态和颜色的单菌落于NA斜面上培养。 2.2拮抗细菌菌的筛选 在培养皿中倒入PDA培养基15mL，取枯萎病菌菌落边缘直径5mm的菌丝块放在平板上的中央；在距中心25mm处两侧分别画直线接种供试拮抗细菌，28℃黑暗培养5d，设不接种拮抗细菌为对照，每个处理重复4次。5d后观察抑菌效果，初步筛选对香蕉枯萎病菌有抑制作用的拮抗细菌，以接种无菌水为对照,测量抑菌带的宽度，观察抑菌效果并计算抑制率。 抑制率 dck1-d1 / dck×100% （dck1：对照组接种枯萎病菌后5d的直线生长距离；d1：对峙培养组接种枯萎病菌后5d的直线生长距离 2.3拮抗细菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用 （1）香蕉枯萎病菌孢子悬浮液的制备：将 FOC4 号小种在PDA平板上培养4 d，挑取菌丝少许，接种于PDA液体培养基的250mL的三角瓶中，28℃，200 r/min，摇床培养5d后，以无菌水稀释，得浓度为10个孢子/mL的孢子悬浮液，放入4℃冰箱中备用。 （2）拮抗细菌发酵液：拮抗细菌菌株置于NA液体培养基上，在30℃下180 r/min振荡培养48h后备用。 取拮抗细菌发酵液100μL加入冷却至40℃左右的15mLPDA培养基中，轻轻摇动使之充分混匀，菌液与培养基充分混匀后倒入直径为9 cm的培养皿中，冷却后于平板中央接种直径为5 mm的香蕉枯萎病菌块，置于28℃下培养4d，以加无菌水为对照，每处理4次重复，测量菌落直径，观察抑菌效果并计算抑制率。 抑制率 dck2-d2 / dck×100% （dck2：对照组接种枯萎病菌后4d的直线生长距离；d2：对峙培养组接种枯萎病菌后4d的直线生长距离 2.4拮抗细菌对香蕉枯萎病菌分生孢子萌发的抑制作用 香蕉枯萎病菌孢子悬浮液 1×10个/mL ，取50μL滴加在凹玻片，再滴加50μL上述的拮抗细菌原液和不同稀释倍数的发酵液，混匀后，置于26℃下培养12h；以滴加无菌水和NB培养液为对照，每处理4次重复,并计算拮抗菌对香蕉枯萎病菌分生孢子的抑制率。 孢子萌发抑制率 [ 对照萌发率-处理萌发率 /对照萌发率] ×100% 附：马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000mL（分离真菌）。 称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白