纤维素酶酶活测定.docVIP

纤维素酶活测定方法 原理 纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。 酶活定义 纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。 二、实验试剂 羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉） 50mmol NaAC-HAC、DNS试剂 三、实验仪器 容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平 四、标准曲线的绘制 表1、葡萄糖标准曲线 管号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS 2 2 2 2 2 2 2 摇匀，沸水浴5min，定容至25ml，测OD540nm OD540nm 以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度OD540nm为纵坐标，做标准曲线。 五、酶活测定 由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。 1、样品的制备 CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na（羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na 0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。 纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。 DNS法测酶活： 取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。混匀测OD540nm。 空白对照用酶活的酶液作对照。 结果计算 纤维素酶活力（U/g） r×Df×1000/180.2/t 式中： r：通过OD540nm值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓度（μg/ml）； 180.2：木糖的相对分子量，g/mol； t：酶解反应时间，min； Df：稀释倍数： 酶活力的计算值要保留三位有效数字。 苏柯汉公司给定的酶活计算公式为： 纤维素酶活力（U/g） r×Df×2×1000/V 式中： r：通过OD540nm值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓度（μg/ml）； V：实验时移取的酶液体积，0.2ml； 2：时间换算，30min的倒数为2； Df：稀释倍数： 酶活力的计算值要保留三位有效数字。 六、最适温度 在最适pH 的条件下，选择一系列温度梯度，分别在30、40、45、50、55、60、65、70、℃下按酶活测定方法测定酶活，确定最适温度。 七、温度稳定性 在最适pH 条件下，将纤维素酶溶液在一系列温度梯度中保温72h，前6 h 每小时测一次酶活，6-10h 每2h测一次，之后12h 测一次。看纤维素酶活变化。 纤维素酶的分离纯化 实验试剂： NaAC、HAC、NaCl 实验方法 纤维素酶的分离纯化 上样缓冲液：0.05mol/L的NaAC-HAC，PH5.0；梯度洗脱液为含0.1,0.2, 1.0mol/L 的NaCl梯度的上样缓冲液。 将买的纤维素酶用缓冲液配成1%浓度的溶液。 用3倍床体积的上样缓冲液平衡柱子，流速0.5mol/min，上样40ml，洗涤2-3个柱体积后开始进行梯度洗脱，收集各组分。 将各收集组分超滤脱盐，浓缩，是浓缩电导率在40uS/cm以下。 真空冷冻干燥：脱盐后的浓缩液经真空冷冻机干燥备用。 （二）、HPLC木聚糖酶纯度 将分离纯化后的木聚糖酶经HPLC检测其组分、纯度。 醋酸－醋酸钠缓冲液 pH3.6 取醋酸钠5.1g,加冰醋酸20ml，再加水稀释至250ml,即得。?　　醋酸－醋酸钠缓冲液 pH3.7 　取无水醋酸钠20g,加水300ml溶解后，加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60～80ml，至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml，即得。?醋酸－醋酸钠缓冲液 pH3.8 　取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml,加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液0.5ml,再加水稀释至1000ml，即得。醋酸－醋酸