细胞工程作业李宁浙.docVIP

小鼠心肌成纤维细胞系的建立 班级： 姓名： 学号： 生命科学与工程学院 2013-11-11 小鼠心肌成纤维细胞系的建立 一.基本原理： 准备工作 器皿清洗、干燥与消毒灭菌，培养基与其它试剂的配置、分装及灭菌，超净台的清洁与消毒，培养箱以及其他仪器的检查与调试。 取材 本实验培养的是小鼠心肌细胞，所以在无菌环境下从小鼠身上切下心肌，经过切碎、消毒等处理后接入培养器皿中。 原代培养 将从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。恒温水浴箱废液缸记号笔加入30～50倍体积的0.25%胰蛋白酶液，消化～min.用100目不锈钢网过滤，滤液离心（1000rpm/min，8min）去上清液于烧杯，加培养液并吹打，然后接种到培养瓶中，置于培养箱培养。 4. 当细胞长到一定数量后，吸掉旧培养液用PBS洗涤细胞一至二次0.25%胰蛋白酶液胰蛋白酶液倒立显微镜下观察1000rpm/min，8min）去上清，移入另一培养瓶中，加培养液置于温箱培养。再向原瓶也加入新的培养液继续培养，反复处理几次。 5. 当细胞长到一定数量后，吸掉旧培养液用PBS洗涤细胞一至二次加入0.25%溶液，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉0.25%溶液。加入适量含血清之新鲜培养基终止作用，离心1000rpm/min，8min）后再吸掉上清液轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 6. 用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化适时去掉胰蛋白酶，加入新培养液吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液用吸管将培养液加入，离心(1000r/min，10分钟)去上清液，加入的，