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PAGE \* MERGEFORMAT 5 微生物大小及数量的测定 09级生科一班 安明玉（200900140001） 同组者：陈汶灿、陈肖然、程彬、高琳璐、秦瑶 实验目的 1.学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。 2.了解血细胞计数板的构造及计数原理。 3.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、实验原理 1.微生物大小测定原理 微生物细胞的大小是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。其测量工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻标准刻尺的载玻片，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100小格，每一小格长度为0.01mm，即10μm。如图1。 图1 镜台测微尺中央部分及镜台测微尺校正目镜测微尺 目镜测微尺，如图2，是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。 图2 目镜测微尺 2.血球计数板测定微生物数量的原理 血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一段横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16小方格（图5-2）；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（10-4mL）。以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则： 1mL菌液中的总菌数= A/5 ×25×10 ×B 图3 血球计数板侧面及两种类型的计数室 三、实验器材 1. 菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)斜面培养物； 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液体培养基培养物。 2. 溶剂和试剂 合成培养基（酵母菌液），稀释的美蓝染液（0.01%），95%酒精，二甲苯溶液，香柏油，无菌水 3. 仪器和其他用品 血球计数板，显微镜，载玻片，酒精灯，接种环，盖玻片，擦镜纸，镜台测微尺，目镜测微尺，无菌毛细滴管，双层瓶，计数器 四、实验步骤 1、微生物大小的测定 （1） 装目镜测微尺 取出接目镜，把目镜上的透镜片旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。 （2）校正目镜测微尺 ①放镜台测微尺 将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。 ②校正 先用低倍镜观察，将镜面测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰的看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数 ③计算 由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算处在不同放大倍数下，目镜测微尺每个所代表的长度。 目镜测微尺每个长度（μm）= 用同样的方法换成高背景和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。(注意：观察时光线不宜过强，否则难以 找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头。) （3）对枯草芽孢杆菌用简单染色法制片 （4）菌体大小的测定 ①枯草芽孢杆菌大小的测定 目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜找到标本后，换油镜测枯草芽孢杆菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小 ②酵母菌大小的测定 测定酵母菌时，先将酵母菌培养物制成水浸片，然后用高倍镜或油镜测出宽和长各占目镜微尺的格数，最后，将测得的格数乘上目镜微尺（用高倍镜或油镜时）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小（注意：可选择有代表性的3~5个细胞进行测定；细菌的大小需用油镜测定，以减少误差） （5）测定完毕，取出目镜测微尺后将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。 2、显微镜直接计数法 （1）镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。 （2）加样