目的基因的表达.ppt

1。外源基因在原核细胞中表达与调控原核细胞表达调控表达分析，纯化及策略2。外源基因在真核细胞中表达与调控 基因表达概述 基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、加工修饰等复杂的生化反应，产生具有生物学功能的蛋白质过程，即DNA→RNA→蛋白质 一、宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ⑵枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。 ⑶链霉菌 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。 基因工程载体分为： 克隆载体 转录载体 表达载体 克隆载体 转录载体 DNA DNA RNA 蛋白质 表 达 载 体 融合表达质粒pBG-2的结构 ㈠ 有效转录及其调控元件 1. RNA聚合酶 2. 启动子及其转录作用的启动（启动子的概念、分类） 3.转录作用的终止 4. 转录的弱化作用 ㈡ 正确转译 1.起始密码子（intiation codon,initiator） 2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列） 基因表达的方式 按对刺激的反应可分为： （一）组成性表达 管家基因（housekeeping gene）--在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。 此类基因只受启动子序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，不受其他机制的调节 (二)诱导和阻遏表达 诱导（induction）--可诱导基因在特定环境信号刺激下表达增强的过程。 DNA损伤 →修复酶基因激活 乳糖 → 利用乳糖的三种酶表达 阻遏（repression）--可阻遏基因表达产物水平降低的过程 色氨酸 —色氨酸合成酶系 基因表达调控的生物学意义 （一）适应环境、维持生长和增殖 （二）维持个体发育与分化 基因表达调控的基本原理 基因表达调控 转录水平调控 转录产物加工 mRNA从核到细胞质 mRNA降解 翻译水平 基因表达调控的基本原理 （一）基因表达的多级调控 转录 翻译 （二）基因转录激活调节基本要素 1.特异DNA序列 调控序列 原核生物: 操纵子(operon)--结构基因连同其上游的调控序列(启动序列 promotor P、操纵序列operator O、其他调节序列)构成一个操纵子 操纵子—原核生物转录单位 启动序列决定转录活性大小 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 负性调节 为主 正性调节 真核生物： 顺式作用元件（cis-acting element）--指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 非编码序列 启动子 调控元件: 位于远端调控区的顺式作用元件(增强子,沉默子) 2 调节蛋白 原核生物： 特异因子--决定RNA聚合酶对启动子序列的特异识别和结合能力(?因子) CAP(分解物激活蛋白, catabolite activator protein) 正性调节 阻遏蛋白--结合操纵序列 激活蛋白--结合启动序列邻近的DNA序列 真核生物：转录因子 反式作用因子（trans-acting factor）--通过与特异的顺式作用元件相互作用方式激活另一基因的转录的蛋白质因子. 顺式作用 自身基因 3 DNA-蛋白质 蛋白质-蛋白质相互作用 DNA-蛋白质相互作用 调节蛋白氨基酸残基侧链--DNA碱基 非共价键 蛋白质-蛋白质相互作用 二聚体 二聚化 同源二聚体 异源二聚体 多聚体 4 RNA聚合酶 （1）启动序列 /启动子与RNA聚合酶活性 启动序列 /启动子核苷酸序列会影响其与RNA聚合酶的亲和力 影响转录启动频率 强启动子 弱启动子 （2）调节蛋白与RNA聚合酶活性 诱导剂、阻遏剂使调节分子构象改变，直接或间接地调节RNA聚合酶转录启动过程 其他表达系统 高效表达目标基因的战略和技术 真核基因 ①编码序列：外显子(exon)