蛋白质电泳操作步骤.docVIP

SDS电泳操作步骤： 试剂配制： （实验中采用均为分析纯） （1）丙烯酰胺贮液丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%） 称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8） 6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。 （3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8） 18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。（）10% （）10% 过硫酸铵：使用前新鲜配制。 （）尿素 （）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺) （）电极缓冲液(1×)0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3 （）电极缓冲液(2×)0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（）样品缓冲液（pH 6.8） 1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) + 2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml. （）考玛斯亮蓝R-250染色方法： 固定液 20%三氯乙酸 b脱色液 250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。 c染色液 称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中.CytC酶解样 每管分别加入8 μl细胞色素C（20 mg/ml），10 ul 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,1 μl胰蛋白酶（细胞色素C：胰蛋白酶=50：1）。37℃水浴，2 h。立即放入-20 ℃冰箱冷冻保存备用。大肠杆菌蛋白 取10μ?工程菌种接入10nml LB液体培养基里，过夜培养12h，取出1ml菌液离心10000g/r，5min。弃上清，用1ml Tris-Hcl （pH 8.0 50mM）洗涤1-2次，后分别加入20μ?（pH8.0 5mM）、10μ?EDTA，-20℃保存。上样前加入2μ? 5%X，再加入50μ?上样BUFFER，75℃水浴5-10min .CytC 15μ? CytC加入15μ?上样BUFFER，75℃水浴5-10min .低分子量肽标准 取8-10μ?Maker（2mg/ml）.SPI多肽的制备 Ⅰ 材料及试剂（试剂均为分析纯） 纯大豆粉 木瓜蛋白酶（sigma P3250 500-2000AU/g） 正己烷 巯基乙醇 Tris-HCl缓冲液（0.03 M、pH 8.0） 0.2 M HCl 叠氮钠 考马斯亮蓝G250 标准牛血蛋白 Ⅱ 制备方法 ⅰ.SPI制备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi 和Yamauchi [9]的方法, 具体步骤如下: 全脂豆粉加正己烷(1/5)室温下搅拌1 h脱脂，于3 000 g 离心5 min, 取沉淀反复脱脂两次, 于沉淀中加入15～20 倍含10 mM 巯基乙醇0.03 M、pH 8.0 的Tris-HCl 缓冲液, 室温搅拌1～2 h, 于20 ℃ 6 000 g 离心25 min,取上清液,用0.2 M HCl 调节pH 至4.8, 置于冰箱下层冷沉过夜, 再于4 ℃ 9 000 g 离心20 min, 取沉淀分散于少量水中, 调节pH 至7.0, 搅拌1 h 充分溶解后于4 ℃下用含0.05 % 叠氮钠的蒸馏水透析2 d, 再用蒸馏水透析两次去叠氮钠, 冷冻干燥即得大豆分离蛋白(SPI)。（可能透析会损失掉一定量的多肽。） ⅱ.SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的标准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见《生物化学实验原理和方法》P174）测得1%（1mg/ml）的SPI吸光度为0.779，求得即在SPI质量分数为1%的情况下，其蛋白浓度约为3mg/ml. ⅲ.SPI多肽制备：本实验采用木瓜蛋白酶水解SPI，制取SPI多肽。标准的酶解体系为溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris-HCl 缓冲溶液的SPI 溶液(质量分数为2%),含质量分数为0.05%的叠氮钠,先于38℃下预热5 min,分别添加蛋白酶至750 AU/mL，然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响SPI多肽的产率，木瓜蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。反应混合物可定期取样并分别加入X- PAGE样品缓冲液终止反应(1: 1, v/v)。实验上样一般采用过夜酶解透析样(2%*5%)。上样前应将酶解样与样品缓冲液混合物水浴。 操作方法： 所制均为1.0mm小板所需体积 （1）配