荧光原位杂交(FISH)资料.ppt

（Fluorescence in situ hybridization,FISH） 原位杂交（ISH） 原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。 基本原理 根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。 3H、35S、125I、32P等 同位素原位杂交的不足之处： 1、不稳定 2、高背景 3、曝光时间长 4、结果统计处理繁琐 5、同位素的使用和处理 几种原位杂交技术 1 基因组原位杂交技术 2 荧光原位杂交技术 3 多彩色荧光原位杂交技术 4 原位PCR 荧光原位杂交 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。 FISH的基本原理 FISH基本原理是利用同源互补的待检染色体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针,经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 发展历史 1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。 20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。 1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。 1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位杂交技术。 他们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。 1974 年，Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生物素与RNA 分子连接起来。 1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。 1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。 1985 年，原位杂交技术被引进到植物。 1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。 20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。 探针的制备 探针（probe)是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列。 杂交实验所选择的核酸探针可以分为三种：化学合成、克隆和PCR。 探针的分类 根据化学组成，可以将探针分为DNA、RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针容易被RNase降解。 肽核苷酸（PNA）探针 PNA寡聚物是一类新分子，其结构与DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰胺）。 PNA与DNA杂交时也遵循碱基互补配对原则 与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度，因此杂交时，受探针变性温度和溶液PH的影响较小，鉴于这些特点和优点，PNA有望取代DNA或RNA作为FIS