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PCR增强剂对药材DNA分子鉴定的影响 　　[摘要] 评价PCR增强剂对中药材DNA分子鉴定的影响，筛选获得适用于中药材DNA分子鉴定的PCR增强剂。文章分别利用CTAB法和碱裂解法提取180个中药材DNA样品，分析在PCR反应体系中使用PCR增强剂对通用引物ITS2， psb A-trn H， rbc L， mat K， trn L-trn F片段PCR成功率的影响及实时荧光定量PCR反应体系中使用增强剂对PCR扩增效率的影响。结果表明BSA与PVP组合可以明显增加ITS2， psb A-trn H， rbc L片段的PCR成功率，且PCR增强剂也能消除位点特异性鉴别假阴性结果，提高分子鉴定的准确性，但降低了实时荧光定量PCR的扩增效率。本研究说明BSA和PVP作为PCR增强剂能增加中药材DNA的PCR扩增成功率和分子鉴别的准确性。 　　[关键词] PCR增强剂；中药材；分子鉴定 　　[收稿日期] 2013-01-19 　　[基金项目] 北京市科技专项“道地中药功能基因组北京市重点实验室2012年阶梯计划项目” 　　[通信作者] *袁媛，E-mail：yuanyuan@icmm.ac.cn 近年来分子鉴定技术已被广泛运用于药材鉴别，其中以PCR技术为核心的药材分子鉴定技术已较为成熟，如RAPD，SSR，PCR-RFLP，位点特异性PCR，DNA条形码技术等均以PCR技术为基础并在在中药鉴定中广泛应用[1-3]。但由于药材来源复杂，且植物药中常含有植物多糖[4]、植物多酚[5]、木聚糖、果胶、腐植酸及一些次生代谢产物如单宁、多胺等，而动物药中常含有胆酸、胆红素、胶原质、肝素、脂质、钙离子[6]等。这些物质作为PCR抑制物，能显著抑制PCR扩增效率，从而影响PCR扩增结果[7]。另一方面，药材DNA的纯度和浓度往往不能满足PCR的需求，也严重制约了药材分子鉴定的效率。研制药材专用PCR增强剂，提高药材DNA的PCR成功率，对于节约研究成本、缩短实验周期，提高药材分子鉴定准确性，促进药材分子鉴定技术的推广具有重要的意义。 　　常作为增强剂用于PCR反应中的物质，依据其作用机理不同可以分为5类：①降低解链温度、促进复杂二级结构模板解链：DMSO（二甲基亚砜）[8]、甜菜碱[9]、甲酰胺[10]、Triton X-100[11]等；②增加酶热稳定性及其活性：BSA（牛血清蛋白）[12-14]、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）[15]、甘油[16]、海藻糖[17]、明胶、gp32蛋白[13]等；③增强DNA聚合酶、引物和模板的结合，促进PCR反应起始复合物形成：PEG（聚乙二醇）、小分子胺[18]、亚精胺[19]、单链结合蛋白[20]、纳米金[21]等；④优化引物和模板的结合，增加PCR特异性扩增：硫酸铵、TMA（氯化四甲铵）[22]等；⑤直接与PCR抑制物结合，阻止抑制物对DNA聚合酶的影响，如BSA，PVP，聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20），DTT（二硫苏糖醇）[16]，gp32蛋白等[13]。研究表明，单用或多种增强剂配合使用均可提高PCR成功的效率[23-24]，但由于PCR增强剂作用原理不同，其适用范围也不同，目前针对中药材的PCR增强剂研究还未见报道。 　　本研究筛选获得一种含有BSA，PVP等成分的PCR增强剂，并分别采用碱裂解法和CTAB法提取180种中药材DNA，利用DNA条形码通用引物ITS2， rbc L， psb A-trn H， trn L-trn F， mat K进行PCR扩增，对不同 Taq 酶种类和浓度、DNA模板浓度、PCR循环数、退火温度条件下PCR增强剂的作用进行了分析，并测试了PCR增强剂在位点特异性PCR中的作用，建立了一种药材专用PCR反应液。 　　1 材料 　　2012年自安徽亳州药材市场，随机收集市售药材180份，其中包括50个果实种子类、22个叶及全草类、31个花类、6个茎木类、57个根及根茎类、14个动物类药材以及其他类药材。 　　2 方法 　　2.1 药材DNA提取 将药材研磨成粉末，取约30 mg药材粉末，利用改良CTAB法提取药材总DNA，提取缓冲液为2×CTAB 提取缓冲液（pH 8.0），包括100 mmol·L-1 Tris-HCl，25 mmol·L-1 EDTA，1.4 mol·L-1 NaCl，2% CTAB。 　　2.2 药材DNA快速提取 将药材研磨成粉末，取约1 mg药材粉末，利用碱裂解法提取药材总DNA，提取缓冲液为0.5 mol·L-1 NaOH，1% PVP，1% Triton-100，中和缓冲液为100 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0）。 　　2.3 PCR反应 以药材DNA为模版，分别利用DNA条形码通