生化实验技术与方法分解.doc

实验一 糖的薄层层析 一 实验目的： (1) 熟悉硅胶H薄板的制备过程与方法； (2) 掌握薄层层析的原理以及利用薄层层析对糖类进行定性分析。 二 实验原理： 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。根据原理的不同，薄层层析通常有4种类型：吸附薄层层析、分配薄层层析、离子交换薄层层析和薄层电泳。薄层层析兼有柱层析和纸层析的优点，操作方便，设备简单，展开时间短，灵敏度高，还可在支持物中加入荧光染料有助于鉴别。本次实验是以硅胶H为吸附剂的薄层层析。 三 实验用品及器材： 试剂：硅胶H、CMC溶液、鼠李糖、葡萄糖、两种糖混合液、展层溶剂（乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比）、显色剂（苯胺-二苯胺-磷酸试剂）； 仪器：薄板、烘箱、微量注射器、层析缸。 四 实验步骤及结果： (1)硅胶H薄板的制备 称取1g硅胶H放入事先准备好的研钵中，缓缓加入4.0mlCMC溶液并研磨，以赶出硅胶当中的气泡，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，用手拿着玻板的一角轻轻震荡，使浆液均匀铺开（注意胶一定要均匀），放在水平台上，带水分蒸发后，置105℃烘箱30min。 (2)板的处理 薄板的活化： 将制备好的胶板放置与105℃烘箱中30min进行活化，活化后放在烘箱中慢慢冷却。 薄板的刮分： 把活化后的薄板放的上部刮成一个扇形，可以使样品展开后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。(3)点样 样品为鼠李糖和葡萄糖的混合溶液，点样量为0μL，为了使样品在点样过程中不至于太扩散，点样时不能一次性挤出微量注射器中的混合溶液，要小心的多点几次，每次5μL左右，等上一次的干了，在点下一次，注意微量注射器的针头不要扎破硅胶。 (4)展层 展层溶剂为新鲜配制的乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比）混合液，点样完毕后将胶板放入层析缸中，室温展开。待展开剂前沿走至距点样位置10cm时，将其取出，用风机吹干。 (5)显色 在通风橱内将展层好的薄板喷上适量的显色剂(苯胺-二苯胺-磷酸)，放入烘箱中烘干。 (6)观察结果 样品距原点距离 前沿距原点距离 Rf值 葡萄糖 cm 9.6cm 0.41 鼠李糖 cm 8.1cm 0.57 混合糖 cm和5.3cm 8.cm 0.44和0.五 结果分析 与混合糖的Rf值有一定的偏差，Rf值Rf值造成的原因可能是：薄层层析板制备时胶板的厚度不一致；活化后在操作的过程中可能有一个胶板受潮，导致毛细孔受到一定的影响；点样时不均匀，而造成结果误差；除此之外，层析时展层的时间不同，也可能会造成一定的误差。与混合糖的Rf值比较相近，结果令人十分满意。 注意事项： （1）制备硅胶板时一点要一边研磨，一边加入CMC溶液，以便赶紧硅胶中的气泡。 （2）涂板完毕用手拿着玻板的一个角落，轻轻震荡使硅胶铺满整个玻板。 （3）薄板活化后冷却的速度不能过快。 （4）点样点的直径小于2mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。 （5）展层试剂不能倒太多，千万不能碰到点样点；胶板的位置一定要放正。 （6）显色剂喷洒要均匀，不能太多，安全操作。 一 实验目的 学习植物体内酶的提取 二 实验原理 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。本次实验是以为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。 从交换剂上洗脱目的物的方法有两种： 1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下失去电荷甚至带相反电荷。 2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代下来。 三 实验试剂及器材 试剂：酶提取液（0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液，含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）、固体硫酸铵、0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/Lβ-巯基乙醇）、EDAE纤维素52、考马斯亮蓝、脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）。 仪器：高速冷冻离心机、恒温水浴、电子天平、柱层析系统、透析袋、电泳槽。 四 实验步骤 1、酶液提取 （1）取2g，剪成小，（2）将已匀浆的酶液转入离心管，0rpm冷冻离心30min。 （3