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引物纯化方式选择指南 2012-2-16 10:24:14 内容导读 一、DNA合成的方法和原理 二、引物纯化的方法原理及其效果 三、纯化方法与应用指南 四、常见问题的原因分析及相应的对策  一、DNA合成的方法和原理 目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。 固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’ →3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→ 5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。 1、脱保护基 (Deblocking) 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5-羟基端，以供下一步缩合反应。 2、活化 (Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体 (其