白藜芦醇对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大的抑制作用.docVIP

白藜芦醇对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大的抑制作用 　　摘要：目的：研究白藜芦醇（resveratrol， Resv）对血管紧张素II（Angiotensin II，AngII）诱导H9C2细胞肥大的抑制作用，并探讨其机制。方法：通过建立Ang II 诱导H9C2细胞肥大模型，采用Image Pro Plus 6.1软件测量细胞表面积大小；BCA法测定细胞总蛋白含量，Western-blot方法检测H9C2细胞p-CREB和CREB蛋白的表达。结果：与对照组相比，AngII（0.1μM）孵育后，细胞表面积增加，细胞蛋白含量增加了46 %（P0.01）。Resv （0.01μM +AngII组，0.1μM +AngII组， 1μM +AngII组）能浓度依赖地减少蛋白含量。Ang II 诱导H9C2细胞p-CREB蛋白的表达升高。不同剂量Resv对AngII 诱导H9C2细胞p-CREB蛋白的表达均有抑制作用，并且呈浓度依赖。结论：Resv抑制AngII介导的H9C2细胞肥厚，其机制可能是通过抑制细胞表面积增大、细胞蛋白含量增多和CREB蛋白表达实现的。 　　关键词：白藜芦醇；血管紧张素II；心肌肥大 　　近年研究证实，白芦藜醇（Resveratrol， Resv）具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗炎、抗氧化、神经系统保护等多种药理学作用[1，2]，它已成为科学家们高度重视的天然活性成分。Resv对心血管疾病作用的研究主要集中在其对心肌缺血再灌注损伤以及氧化应激损伤的影响，但Resv对心肌肥厚影响的研究较少。本实验我们主要观察了白藜芦醇对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大及CERB蛋白表达相关机制研究。 　　1、材料与方法 　　1.1药品及试剂 　　白藜芦醇购买于中美华东制药有限公司（98%，HPLC）。AngⅡ购自美国Sigma公司，兔源p-CREB、CREB单克隆抗体均购自美国Cell signal 公司，兔源Actin多克隆抗体购自武汉博士德生物技术公司。 　　1.2 H9C2细胞培养 　　将正常培养的H9C2 细胞从培养瓶中消化下来后，细胞密度为1×104个/ml ，接种于六孔板中，用含10% FBS的高糖DMEM培养液于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养48 h后，换用含1% FBS的DMEM培养液培养24 h，使细胞生长进入同步休止期。细胞随机分为：Control组、DMSO组、DMSO+Ang II组、Ang II组+白藜芦醇低、中、高剂量组。 　　1.3心肌细胞表面积的测定 　　药物处理好的心肌细胞用含1% FBS的DMEM培养液漂洗一次，每组随机选取10个视野，用相差显微镜100×拍照，用Image Pro Plus 6.1软件测量细胞表面积，每个视野选5～8个细胞，随机六次实验。 　　1.4蛋白免疫印迹技术 　　1×106～1×107细胞，PBS清洗3次，每次5min，之后于细胞培养瓶中进行裂解。总蛋白12000r/min，离心10min提取上清总蛋白。用10%的分离胶分离总蛋白90min。将蛋白质转移到PVDF膜上。室温封闭2h。一抗4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次（10min/次），二抗室温孵育60min。TBST洗膜3次（10min/次），扫膜，出结果。 　　1.5统计学分析 　　实验结果采用SPSS15.0统计软件分析，结果以均值±标准差（mean±SD）表示，统计方法为t检验和单因素方差分析（one-way ANOVA），P0.05为差异有统计学意义。 　　2、结果 　　2.1 Resv对H9C2心肌细胞表面积的影响 　　H9C2肥大细胞模型的成功建立 　　Control组心肌细胞呈梭形（图1），AngII组细胞表面积明显增大。测量结果表明，与Control组相比，DMSO+AngII组与AngII组间心肌细胞表面积变化无显著性差异（P0.05），AngII组的细胞表面积增加至2.55+0.28倍（P0.01）（表1）。Resv 0.01μM+AngII组心肌细胞表面积增加至2.19倍，Resv 0.1μM+AngII组心肌细胞的表面积增加至1.99倍；Resv 0.1μM +AngII组心肌细胞的表面积增加至1.25倍。与AngII组相比，Resv 0.01μM +AngII组心肌细胞表面积减少了14 %（P0.01）。Resv 0.1μM +AngII组心肌细胞的表面积减少了23%（P0.01），Resv 1μM +AngII组心肌细胞的表面积减少了35 %（P0.01），呈浓度依赖（表2，图2）。 　　2.2 Resv对H9C2心肌细胞总蛋白含量的影响 　　与 Control组相比，Ang II组心肌细胞蛋白含量增加至1.51倍，DMSO组与Ang II组心肌细胞