实验四小牛胸腺DNA的制备.docVIP

实验五 小牛胸腺DNA的制备 一、实验目的 1. 了解DNA的存在状态，增加感性认识。 2. 掌握DNA的制备方法以及细胞分级，细胞核制备，细胞膜裂解和解离DNA-蛋白复合体（DNP）的技术。 3. 学习用紫外分光光度计测定DNA含量的方法。 二、实验原理 核酸是重要的生物大分子。在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。因此，在提取和制备DNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。 在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl 浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0 mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14 mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。 提取出DNA-蛋白质复合体（DNP）后，还必须将其中的蛋白质除去，因此，提取纯化DNA要经过以下四个步骤： 1. 制备细胞核； 2. 裂解细胞核； 3. 解离DNA—蛋白质复合体； 4. 从可溶性物质中分离出DNA。 小牛胸腺、猪脾、鱼精子和植物种子的胚胎等生物材料，细胞核含量比例大，因而含有丰富的DNA，是提取DNA的好材料。本实验以小牛胸腺或猪脾为材料。小牛胸腺不仅DNA含最高，而且其脱氧核糖核酸酶（DNase）的活性较低，在制备过程中由此酶所引起的DNA降解损失也较小。为了防止DNase的作用，在用于提取的缓冲液中均含有1mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螫合剂，以除去保持 DNase活性所必须的Mg++离子。为防止DNA的变性和降解，操作要尽可能在低温下进行。 本实验通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。 提取纯化后的小牛胸腺DNA用紫外分光光度法进行鉴定分析，并计算其收率和纯度。 本实验所得的DNA样品将用于实验五的Tm测定。 三、器材与试剂 器材： 1. 高速冷冻离心机，50ml塑料离心管，300ml塑料离心管 2.食品加工机和高速分散器 3. 恒温水浴 4. 磁力搅拌器 5. 量筒：50ml、250ml、500ml 6. 烧杯：100ml、500ml、1000ml 7. 具塞三角瓶：250ml 8. 小培养皿 9. 吹风机 10. 可扫描的紫外分光光度计 试剂： 0.01M柠檬酸钠－9mg/ml Nacl－1mmol/L EDTA ，pH 7.0，300ml b. 0.15M柠檬酸纳－1mmol/L EDTA，pH 7.0 ，300ml 20% SDS （公用） 氯仿－异戊醇（24 : 1）混合液 500ml 95% 乙醇和无水乙醇 丙酮 0.1mol/L NaOH 四、实验步骤 1.制备细胞核 ⑴ 取小牛胸腺（或猪脾）在冰块上去除脂肪和结缔组织，切碎，称10g，放入食品加工机，加入予冷的试剂a.溶液60ml，打碎三次，每次20秒，仃20秒。将打碎后溶液倒入小烧杯，用高速分散器匀浆三次，每次20秒，仃20秒。 ⑵ 将匀浆后溶液分装于两个50ml离心管，仔细平衡后，用高速冷冻离心机，4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清（脂肪层等）留沉淀。 ⑶ 将沉淀置于小烧杯，加50ml予冷a液，用高速分散器同样再匀浆分散三次，同样4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清留沉淀。 ⑷ 取出沉淀加60ml予冷b液，再高速分散二至三次，每次分散10秒，仃10秒。 2. 裂解细胞核 将悬浮液移入250ml烧杯中，在磁力搅拌器上边搅拌边滴入8ml 20% SDS，应观察到溶液明显变粘稠（报告中回答：为什么？）。用55℃水浴温热10min～15min，然后在搅拌下缓慢加入8～10g NaCl，再搅拌10min，使NaCl全溶，此时应观察到溶液变稀（为