第九章_凝胶过滤及离子交换层析介质解析.ppt

8、凝胶层析的基本操作 1）层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。 层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。 一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25～1:100之间。 用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。 2 ）装柱（凝胶层析柱） a.除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定; b.应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除; c.将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 d.先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％; e.柱颈接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产生气泡; f.柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂; g.柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍柱体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来; h.调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静力压，不要超过规定值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者10％。 i.检查柱装得是否均匀和V0的测定： 用一个为该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品进行层析。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装得不好。此大分子的洗脱体积(Ve)就是该凝胶柱的空体积(V0)。 蓝色葡聚糖(blue dextran)2000是平均分子质量为2×106Da并与蓝色染料偶联的一种葡聚糖，通常用它来测 V0，对于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和6 ％以上的琼脂糖凝胶均可用0.2 ％浓度的蓝色葡聚糖2000，它在265nm及630nm处都有吸收峰。 3）洗脱液的选择 在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其他层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。 由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH值范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。 为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。 4 ）加样量 加样要尽量快速、均匀。 加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低; 加样量的多少要根据具体的实验要求而定 凝胶柱较大，加样量较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。 一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％～3％(质量分数)左右。 从洗脱峰上看， 如果所要各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量； 如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。 注意：样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的黏度不能过大，否则会影响分离效果。 可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。 5）洗脱速度 要恒定而且合适 方法：a.使用恒流泵，b.恒压重力洗脱。 洗脱速度取决于柱长、凝胶种类、颗粒大小等。 洗脱速度慢，样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好，但过慢会造成样品扩散加剧，区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间延长。 选择合适的洗脱速度，可以通过预备实验来选择。 一般凝胶的流速是2～10 ml／h，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。 总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。 如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，可用离子交换层析方法进行分离。 离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 二、 离子交换层析 适用于蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物的分离纯化。生化分离中约75%的工艺用离子交换法。 1、原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离。 主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异进行分离。 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。含有酸性基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，含有碱性基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。 阳离子交换基 强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤