非洲猪瘟病毒P72单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立要点分析.ppt

非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立 研究生：朱 红 导 师：孙怀昌 教授 研究背景 是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起猪的一种急性、热性、高致死性的传染病。 强毒株感染的发病率和死亡率可达100%，OIE将其列为国际A类疾病。 在非洲国家广泛流行。 无有效疫苗进行防治。 研究背景 形态特征（图1） 复制方式：胞浆内 分类：非洲猪瘟病毒科 是唯一一种DNA虫媒病毒 研究背景 VP72 参与病毒吸附和进入细胞的四种主要蛋白之一。 占病毒粒子蛋白的32%，是一种非常保守的抗原性蛋白,对自然感染具有免疫原性。 是血清学检测的理想抗原。 研究背景 常规实验室诊断技术 血吸附试验 敏感猪接种试验 PCR 免疫荧光 ELISA 研究目的及意义 诊断的意义 目前尚无理想的疫苗对非洲猪瘟进行预防。 抗体诊断的目的 发病猪产生的IgG抗体在体内能持续很长时间，特别适用于亚急性和慢性病例的检出。 单克隆抗体的优势 特异性强 高效，灵敏，便捷，成本低 研究内容一 非洲猪瘟病毒P72单抗的制备 技 术 路 线 免疫原的制备 检测用抗原的制备 筛 选 结果 筛选到五株阳性克隆，命名为3E9、3E11、4A8、4H2、6E5。 单克隆抗体的效价测定 结论：细胞上清效价在27~212之间，腹水效价可达216。 单克隆抗体的亚类鉴定 单克隆抗体的抗原识别 间接ELISA Dot-ELISA Western blotting 间接ELISA结果 Dot-ELISA结果 Western blot iELISA抗体检测方法的建立 抗原最佳稀释度的测定 单抗稀释液的选择 灵敏性试验 抗原包被板保存期的测定 小 结 获得5株抗ASF-VP72阳性的杂交瘤细胞株 腹水效价可达到216 亚类鉴定为IgG2b 建立了间接ELISA抗体检测方法 4ug/ml的融合蛋白GST-VP72S作为包被抗原 碳酸盐缓冲液为包被液，37℃包被2h作为包被条件 5%脱脂乳作为封闭液，4 ℃封闭过夜作为封闭条件 0.5MNaCl+PBST(0.5%Tween-20)为冲洗液 单抗腹水的工作浓度为1：800，二抗工作浓度为1：1000 该检测方法具有较高的特异性和灵敏性。 THANKS！ 4.7 7.1 10.46 16.46 22.5 29 P/N 0.065 0.309 0.462 0.678 1.070 1.463 1.886 OD490 阴性 ×1600 ×800 ×400 ×200 ×100 ×50 模拟血清 稀释倍数 结论：模拟血清稀释到1600倍仍可以检测到阳性，说明该方法具有较高的灵敏性。 7.6 7.8 7.8 8.2 7.9 8.3 P/N 1.259 1.267 1.199 1.208 1.345 1. 339 OD490 第60天 第50天 第40天 第30天 第20天 第10天 -20℃放置抗原包被板OD值和P/N的变化 4℃放置抗原包被板OD值和P/N的变化 8.8 9.3 9 8.9 8.9 9.6 9.6 P/N 1.32 1.401 1.35 1.339 1.338 1.445 1. 438 OD490 第7天 第6天 第5天 第4天 第3天 第2天 第1天 结论：按此方法包被的酶标板在-20℃至少放置60天，在4℃至少放置7天。 统计学t测验分析 P=0.321≥0.05 差异不显著 统计学t测验分析 P=0.190 ≥0.05 差异不显著 * * 非洲猪瘟（African swine fever ） 非洲猪瘟病毒（ASFV） 下一页 返回 有囊膜、二十面体对称、双股DNA 病毒； 病毒粒子堆积于胞浆中，平均直径200 nm ,结构复杂。中心部为一个电子密度大的类核体，周围为清晰的六角形外壳。 基因组约为170 ~210kb。 研究背景 抗 原 的 制 备 免 疫 BALB/c 小 鼠 融 合 筛 选 鉴 定 重组细菌pGEX-VP72 表达融合蛋白GST-VP72 免疫小鼠 SDS电泳 定量 IPTG诱导 切胶、磨胶 泳道1：pGEX-VP72未诱导全菌 泳道2：pGEX-VP72诱导沉淀 M：蛋白质预染Marker。 ↖ ↖ 免疫用蛋白表达鉴定 KD 1 2 M 117 85 49 34 25 19 重组细菌pGEX-VP72S 表达GST-VP72S 纯化GST-VP72S 4℃或 -20 ℃保存备用 IPTG诱导 Glutathione Sepharose 4B 方阵滴定法 定量 包被96孔反应板 M：低分子量蛋白质marker 1：未纯化的GST-VP72s 2：纯化过的GST-VP7