310总RNA提取-逆转录-PCR方法.docVIP

一、总RNA的提取： 将细胞培养液倒掉，立即加入Trizol试剂，每瓶1ml，反复吹打，室温静置5-10min； 将细胞吸入1.5ml EP管中，每管加 入200ul氯仿，旋窝振荡器剧烈震荡15s，冰上孵育10min； 4℃、12000g离心15min，收集上层无色水相到新的1.5ml EP管中； 加入等量异丙醇（约500ul），轻柔颠倒混匀，冰上孵育15min（沉淀RNA）； 4℃、12000g离心15min，弃上清； 加入1ml 75%乙醇并震荡（将沉淀弹起即可，乙醇要用DEPC水配制）； 4℃、12000g离心5min，弃上清； 空气中（超净台内）干燥20-25min； 加入20-30ul DEPC水溶解RNA； 分装后，-80℃保存。 二、逆转录： 按以下体系配反应液： 总RNA 5ug Oligo dT 18 primer 1ul DEPC水 加至 12ul 短暂离心后，70℃反应5min，立即放冰上冷却。 以上反应液在冰上加入以下成分： 5×reaction buffer 4ul RiboLock RNase Inhibitor 1ul 10mM dNTP Mix 2ul RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1ul 总体积为20ul，轻柔混匀后短暂离心。 42℃ 60min，70℃ 5min。 三、Real