稿号200912115 刊用形式 技术与方法 人YB.doc

人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其制备 李 朴，孔飞飞，余雪梅，成 凤，涂植光 （400016 重庆，重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室） [摘要] 目的 构建YB-1原核表达系统，表达后纯化YB-1蛋白制备。方法 采用RT-PCR扩增YB-1编码序列，将该序列克隆至载体pET-32a + ；转化BL21 DE3 ，确定最佳表达条件；采用亲和层析与超滤纯化目的蛋白，Western blot鉴定后免疫家兔，制备其抗体。结果 成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体；SDS结果显示，表达条件经优化后（28℃, 5h, 0.5mmol/L IPTG），YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达；Western blot结果证实，表达产物经后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白，将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体。结论 成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法，并制备了其抗体。 [关键词] YB-1；原核表达；亲和层析；多抗制备 [中图法分类号] [文献标志码] A [基金项目] 国家自然科学基金（座机电话号码） [通信作者] 涂植光，电话： 023 座机电话号码，E-mail: tuzhiguang@ Y-box结合蛋白1（Y-box binding protein 1, YB-1）为人类细胞中广泛表达的Y-box结合蛋白家族之一。YB-1含324个氨基酸残基，相对分子质量42×103。研究发现，YB-1参与mRNA的选择性剪接、稳定和翻译功能调控、DNA的修复、细胞增殖和再生调节，表现出多功能核转录调控因子特性[]。研究表明，YB-1在恶性肿瘤的发生、发展以及化疗耐药性中起关键作用[]。尽管研究证实YB-1在多种肿瘤细胞中呈异常高水平表达，提示YB-1可作为肿瘤的临床诊断或判断预后的标志物。但到目前为止，针对YB-1对恶性肿瘤的诊断以及肿瘤预后判断的相关研究报道甚少。 本研究拟构建携YB-1编码序列的原核表达载体，将其转入BL21 DE3 ，表达纯化以获得YB-1融合蛋白，并进一步制备其多克隆抗体，为研究血浆YB-1作为一种生物标志物在恶性肿瘤诊断及化疗耐药性判断的临床应用提供了基础。 1 材料与方法 1.1 菌株、质粒、培养基和生长条件 人乳腺癌细胞系MCF-7、大肠杆菌DH5αBL21 DE3 、载体pET-32a + 由本室保存。MCF-7用DMEM 37℃培养；DH5α、BL21 DE3 常规培养用LB培养基，37℃振荡培养；羧苄青霉素二钠的工作浓度为50μg/ml。 1.2 主要试剂 RT-PCR Kit、连接限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司；RNA质粒试剂盒PVDF膜购自Sigma公司；蛋白质购自Fermentas公司；YB-1 mouse monoclonal Antibody 购自Santa Cruz公司；Ni-NTA his Bind Resin、Ni-NTA缓冲液试剂盒为Merck公司产品；引物委托上海英俊公司合成。 1.3 方法 1.3.1 YB-1基因编码序列的PCR扩增及原核表达载体的构建 细胞总RNA提取及cDNA制备 收集对数生长期的MCF-7细胞提取总RNA，并以此为模板进行RT-PCR以制备cDNA。总RNA提取及RT-PCR操作参照试剂盒说明书进行。 目的片段的PCR扩增 根据GenBank中YB-1 mRNA序列中的序列（NM_004559.3），设计并合成YB-1 基因编码序列的PCR扩增引物（YB-1-F: GGATCCATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAGCAGCCG，YB-1-R:AAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAGCCCCGCCCTGCT；下划线部分为酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，YB-1-R中斜体部分为设计增加的His-tag序列）。 以制备的cDNA为模板，YB-1-F和YB-1-R为引物，PCR扩增YB-1序列。PCR反应体系如下：5×PCR PrimerSTAR Buffer Mg+ plus 10μl，dNTP Mixture 4μl，模板1μl，引物各1μl，DNA Polymerase 0.5μl，补ddH2O至50μl。反应条件：98℃预变性30s；98℃ 10s，60℃ 15s，72℃ 1min，共30个循环；72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。 pET-YB1原核表达载体的构建 PCR产物与载体pET-32a + 经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后连接，连接产物转化感受态DH5α，涂布于含羧苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜；次日挑取单菌落增菌，提取质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定