第一型类胰岛素生长因子基因转殖小鼠之产制与分析.docVIP

第一型類胰島素生長因子基因轉殖小鼠之產製與分析 Generation and analysis of insulin-like growth factor-I transgenic mice 研究生：劉意勤 Liu, Yi-Chen 指導教授：謝來安 Hsieh, Lai-An 蘇弘毅 Su, Hung-Yi 【摘要】 第一型類胰島素生長因子 insulin-like growth factor Ι, IGF-Ι 為一剌激組織增生 mitogenic 作用之多胜肽，它具有媒介生長激素 growth hormone, GH 在內分泌或自分泌 autocrine /副分泌 paracrine 的作用。本研究藉由牛α-乳白蛋白基因 α-lactalbumin, α-LA 啟動子與綿羊IGF-Ι ovine IGF-Ι, oIGF-Ι cDNA之序列所構築之轉殖基因，藉原核 pronucleus 顯微注射方式探討不同品系、注射針有無矽化與不同胚移置時機對於注射效率之影響，並利用區別染色法探討經不同處理之發育囊胚，對滋養外胚層細胞 trophectoderm cells, TE 和內細胞群（inner cell mass, ICM）組成之變化，且測試基因轉殖小鼠性腺傳承及其後代仔鼠離乳體重。結果顯示，不同品系小鼠原核胚經顯微注射後，FVB/NJ 品系與 ICR 品種比 C57BL/6J 品系在各發育期數目較多 P 0.05 ，因此這二品系小鼠適合應用基因於轉殖研究。注射針有無矽化 siliconized 處理對顯微注射原核胚存活率無顯著影響 P 0.05 ，因此在注射過程中應可省略注射針矽化處理步驟。注射後立即進行胚移置與隔天進行胚移置在仔鼠出生率上並無顯著差異。經原核顯微注射（pronuclear injection, PI）或細胞質顯微注射（cytoplasm injection, CI）之發育囊胚，在區別染色法後，其細胞總數顯著減少（P 0.05）。此 PI 或 CI 處理後導致囊胚細胞總數減少與 ICM 細胞生長受到顯著抑制有關 P 0.05 ，在進一步結合顯微注射與胚移置後，顯示體內生長 in vivo 組較體外培養 in vitro 、注射後立即胚移置 PIE 及未注射立即胚移殖 PE 等三組之 ICM 數較多，呈顯著差異 P 0.05 ；在 in vivo方面， TE 數在 PE 組無顯著差異 P 0.05 ，顯示原核胚經機械性注射後 PI 或 CI ，其後續發育之囊胚的結構受到影響，此結果或許可能造成胚胎在懷孕期有較差之發育能力。而且不論是胚移置或 PI 處理都會對胚產生一定的傷害，但如能在PI完成後即刻進行胚移置，TE、ICM 與總細胞數量都有稍許恢復的現象。本研究共顯微注射532個小鼠原核期之胚，經 PCR 及自動定序檢測，証實所生仔鼠中有2隻帶有 IGF-Ι 轉基因，並具有性腺傳承之能力。基因轉殖母鼠生產之後代，離乳時體重較一般野生型母鼠後代有較重之趨勢。綜合以上結果，顯示已成功建立 IGF-Ι 基因轉殖小鼠模式，此將有助於未來產製及分析基因轉殖家畜。 關鍵字：小鼠、顯微注射、區別染色法 【Abstract】 Ι IGF-Ι is a polypeptide that can stimulate cell mitosis and mediate many endocrine and paracrine / autocrine actions of growth hormone. The purpose of this study was to set up suitable conditions for producing IGF-Ι transgenic mice. Transgenic gene construct was made by linking a bovineα-lactalbumin αLA promoter to an ovine IGF-Ι cDNA. The study emphasized on improving the efficiency of pronuclear microinjection and examining embryos by differential staining that is able to distinguish the inner cell mass ICM from the trophectoderm TE cells. Our results showed that the number of developing embryos from FVB/NJ and ICR mice were higher