Ni2+柱层析方法.docVIP

2.5.1 重组蛋白粗酶液的获取 1 挑取重组大肠杆菌菌落于LB Amp+培养基中，30oC培养，230rpm。 2 按1：100比例接种到新的LB Amp+培养基中，30oC培养，230rpm， OD600≈0.6时开始诱导，IPTG终浓度为0.75mmol。 3 诱导7h后，4oC，5000g，5min离心收集菌体； 4 菌体用灭菌ddH2O重悬洗涤，4oC，5000g，5min离心收集菌体； 5 用1×binding buffer重悬菌体，采用超声破碎法破碎菌体； 6 超声破碎液于4oC，30000g，离心20min收集上清备用。 2.5.2 Ni2+柱的活化 1 充分悬浮柱填料保存液，取2mL装入柱中，静置（柱体积CV：1.5mL）； 2 设置柱流速10CV/h，待柱中保存的20%乙醇流至柱顶部时，加入3CV ddH2O洗柱； 3 待柱中ddH2O流至柱顶部时，加入5CV 1洗柱1×charge buffer； 4 待柱中1×charge buffer流至柱顶部时，加入5CV 1×binding buffer洗柱；柱 填料保存于1×binding buffer中。 2.5.3 重组蛋白的纯化 以超声上清上样，分别用10CV 1×binding buffer、10CV 1×wash buffer、3CV 1×elute buffer、3CV 1×strip buffer洗涤层析柱，每1mL收集一管，4oC保存备用。 1.3.4 Ni-NTA 系统缓冲液 8×binding buffer ：咪唑 40mmol/L ， NaCl 4mol/L ， Tris-Cl （ pH 7.9 ） 160mmol/L，加水至1000mL，调pH 至7.9，配制8×binding buffer，工作浓度为 1×binding buffer。 4×elute buffer：咪唑 4mol/L，NaCl 2mol/L，Tris-Cl （pH 7.9）80mmol/L， 加水至1000mL，调pH 至7.9，配制4×elute buffer，工作浓度为1×elute buffer。 8×wash buffer：咪唑 480mmol/L，NaCl 4mol/L，Tris-Cl （pH 7.9） 160mmol/L， 加水至1000mL，调pH 至7.9，配制8×wash buffer，工作浓度为1×wash buffer。 4×strip buffer：EDTA 400mmol/L，NaCl 2mol/L，Tris-Cl（pH 7.9） 80mmol/L， 加水至1000mL，调pH 至7.9，配制4×strip buffer，工作浓度为1×strip buffer。 8×charge buffer：硫酸镍 400mmol/L，加水至1000mL，配制8×charge buffer， 工作浓度为1×charge buffer。