用BRET方法活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项.docVIP

用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项 K. M. Kroeger1, K. A. Eidne1, Bernd Hutter2 简介： BRET已经成功的应用于研究哺乳动物细胞中GPCR同源和异源二聚体以及涉及到受 体脱敏作用和交易的受体/β-arrestin相互作用（综述，1）。BRET的显著优势是可以在活细胞中，正确的的位置实时的监测蛋白质和蛋白质之间的 相互作用。由于GPCR高度的疏水性和细胞本地化，测量蛋白质之间相互作用的常规技术（如：免疫共沉淀和酵母2杂交筛选）具有重大的缺陷。BRET是一个 简单的，快速均一法，可以克服这些限制。对7TM受体是一个普遍的过程。这个方法可以作为研究非依赖于他们信号通路的几乎所有7TM受体的筛选方法。 BRET原理 BRET是一种自然发生的现象，举个例子：在水母和海蜇中发生的水母素和GFP之间 发生的非放射性能量转移。可以通过标记了生物发光供体如：海肾的荧光素酶（Rluc）或者荧光受体如：增强型绿色或者黄色荧光蛋白（EGFP或EYFP） 的融合蛋白来研究BRET的相互作用。 当相互作用的部分在细胞内共表达，在底物腔肠素存在的情况下，当蛋白质距离足够近（在100?内）， 将发生能量从Rluc到EYFP的能量转移，发出发射光（2）。依靠于供体和受体分子的严格的距离使BRET成为研究涉及到所有GPCR功能和通过激动剂