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质粒DNA抽提实验报告 实验目的： 1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。 2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。 实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 实验仪器及试剂： 1.5mlEP管、高速离心机、移液枪 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0） 2毫克/毫升 溶菌酶 溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc （pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 实验步骤: 取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次） 2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞 3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min 4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min 5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min 6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干 8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用 五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNA PCR以及电泳实验报告 实验原理： PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。 二．实验仪器及试剂： EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪紫外透射检测仪等 DNA模板与特定DNA模板结合的引物去离子水商业化的DNA聚合酶以及缓冲液dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶 PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl 操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s 电泳检测 实验结果分析 分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表 如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的 对照组 实验组 750bp 500bp 1000bp 2000bp 100bp 250bp