培训课件-核酸杂交技术.pptVIP

第四节 影响杂交信号检测的因素 在核酸杂交反应中影响杂交体形成因素较多，主要有探针的选择、探针的标记方法、探针的浓度、杂交率、杂交最适温度、杂交的严谨性、杂交反应时间及杂交促进剂等。 一、探针的选择 在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。 但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。 二、探针的标记方法 探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。 但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。 三、探针的浓度 随探针浓度增加，杂交率也增加。 在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。 探针浓度过低会降低杂交的灵敏度，过高又会增加背景的染色。 一般认为，最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最大结合度的最低探针浓度。 四、杂交率 传统杂交率分析主要用于DNA复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。 五、杂交温度 理想的情况是在杂交速率最大的温度条件下进行杂交反应 对RNA：DNA杂交来说，最大速率的产生点为Tm值下10~15℃； 在DNA：DNA杂交中选择低于Tm值20~25℃的杂交温度。