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药学专业外语阅读 姓名： 专业：药理学 指导老师： 新型超分子物质[ 2 ]轮烷对体外黑色素瘤细胞和结肠癌细胞中Caspase（半胱天冬酶）信号转导通路的影响 摘要：我们研究了超分子物质[ 2 ]轮烷（troa0001）对半胱天冬酶的信号转导和癌细胞株的细胞活力的影响。tro-a0001抑制细胞增殖,并具有浓度依赖性。暴露于troa0001的细胞其裂解形式caspase-3和PARP（腺苷酸二磷酸核糖转移酶）的表达明显升高。经过tro-a0001的作用Bax的表达增加了。此外，通过siRNA下调Bax蛋白表达导致显著的生长活化作用。形态学分析表明，tro-a0001增加了人类癌细胞细胞株的细胞凋亡水平。这些结果表明，tro-a0001可以诱导癌细胞凋亡，有望作为一种新的潜在抗肿瘤药物。关键词：[2]轮烷，超分子化合物，细胞凋亡 目前癌症在全世界上都是导致死亡的罪魁祸首。因此迫切需要开发抗癌药物。大部分抗癌药物只有被癌细胞吸收才能发挥作用，而具有相对较低的分子量和稳定的结构的药物可以很容易地在细胞膜上通过扩散系统或运输方式被细胞吸收。然而，抗癌药物，很容易被吸收，也常常很容易从细胞中排泄，其作用可能不能得到有效控制。同时他们的使用可能会伴随着严重的药品不良反应和多药电阻（1）。因此，一个新的种子化合物对未来抗癌药物发展是必要的。我们已经合成了一种新型超分子物质【2】轮烷（tro-a0001）（图1A），这是一个独特的缺少一个共价键（2–4）的高分子化合物。 在通过细胞凋亡来控制癌细胞的治疗中，普遍认为对线粒体介导的信号通路、caspase-3和其他蛋白酶的治疗手段的关注是很重要的（5–7）。本研究的主要目的是确定[ 2 ]轮烷是否具有抑制癌细胞生长的生物活性，其机制是否与对caspase-3或另一种蛋白酶的作用有关。 目前[2]轮烷的研究中使用的是[ 2 ] [二（2（3））乙基铵三氟甲磺酸[二苯并-24-冠-8 ]轮烷（TRO-a0001）。a0001 TRO和二（2 -3,5 乙基）三氟甲磺酸铵（nk7 40 2），后者为前者轴的一部分，两者都是由日本高田实验室合成的（8）。二苯并-24-冠8醚构成a0001 TRO轮的部分，购买自东京化工实业（东京）。这些化学物质在DMSO（二甲基亚砜）中被溶解。 这项研究中应用的细胞包括，人类的高加索人恶性黑色素瘤细胞株G361和人结肠癌细胞系DLD-1 欧洲收集细胞培养，英国 ,小鼠黑色素瘤B16细胞/ BL6,和鼠标直肠癌细胞株Colon-26 发展研究所、衰老和癌症，东北大学，日本 。这些细胞被培养于1640无血清细胞冻存培养基中 美国生命科技 ，加入10%胎牛血清和青霉素 50单位/毫升 ，链霉素 50 g / ml 。空气环境为含5%二氧化碳的潮湿空气。 对活细胞和其增殖的定量研究，我们用MTT法测定，并用酶标仪分析结果（贝克曼库尔特，USA）。细胞（5×103细胞/孔）被添加到96孔板中（50?L）加入含10%胎牛血清的1640培养基中。培养12 h后，细胞用不同浓度的tro-a0001处理（2.5，5，10mol/L 的TRO-a0001溶解于0.2%DMSO溶液。对照组用0.2%二甲基亚砜单独处理。不同浓度的TRO-A0001给药后的活细胞数量根据吸光度与细胞数量的标准曲线来计算。 免疫印迹法方法用于分析caspase-9，caspase-3，caspase-7，聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），和Bax蛋白（抗体购自美国细胞信号技术公司）。给TRO24小时后的细胞溶解产物在4°C下离心15分钟（14000×G），取上清液用于蛋白质样品。等量的蛋白质样品（2.5?G）由10%的十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分离，转移到聚偏二氟乙烯膜（美国Bio-Rad实验室）而得到。 Bax和非靶向控制小干扰RNA（siRNA）可通过细胞信号转导技术获得。细胞接种于6孔培养板且在完全培养基培养24小时（60%–80%聚集）。培养后，在100 nm制程控制和Bax siRNA下运用TransIT-siQUEST转染试剂进行细胞转染24–48小时。转染细胞获得后，接种于96孔培养板测量细胞活力，如下所述。 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP -end标记通道 测定凋亡细胞。我们用Click-iT Alexa Fluor 594染料末端标记法成像技术检查由TRO-A0001引起的细胞死亡。TUNEL-阳性细胞和细胞核用hoechest 33342染料染成红蓝色。另一个对照组添加脱氧核糖核酸酶。图像由荧光显微镜获得（基恩士公司，大阪）。 结果通过单方差分析，然后TK检验确定各组间的差异。所有的数据如果平均值±SEM P＜0.01被认为是有统计学意义的。 用tro-a0001处理