DNA测序常见问题及其分析资料.docVIP

测序常见问题及其分析 HTUTU/news/2007/9/5shtmlUUTTH) 1、PCR产物测序时出现重叠峰 　　问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码） 　　图1-1 　　图1-2 　　解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。 　　问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一） 　　图2 　　解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。 　　问题图3（测序引物有碱基缺失） 　　测序引物有碱基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。 　　解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化 　　2、克隆测序时出现峰形重叠 　　原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染 　　解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落）