蛋白表达纯化实步骤.docVIP

蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。 蛋白的诱导表达。 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 SDS电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。 包涵体检测。方案见 附件2 如有上清表达，则扩大摇菌。 取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。 将菌液6000rpm，4min，4度 离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 超声波裂解。 用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。 取得上清 1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。） 纯化上清摸洗脱条件。 镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。 将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。 分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。 注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。 加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。 加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。（尿素可能对NI柱有损伤。） 注意：所有溶