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分子生物科学 1.强强联合：在CRISPR/Cas9相关研究中应用新一代测序技术 一.引言在分子生物学的发展历史中，人们曾经不止一次地从微生物的某些生命活动中得到启示，发展出了对于DNA操作有重要意义的工具，如分子克隆用的限制性内切酶和PCR用的耐热聚合酶。它们为分子生物学的发展带来了革命性的影响。近两三年来，另一种从细菌的获得性免疫系统发展而来的革命性的基因操作工具CRISPR/Cas9受到广泛关注，其应用和影响范围仍在不断扩大。CRISPR/Cas9系统的发现与DNA测序技术分不开，它的发展与推广仍然得益于DNA测序技术。CRISPR/Cas9技术与近五、六年来同样快速发展的DNA新一代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS, 也称高通量测序技术)相结合，不但可以使研究者高效快速地得到一些实验结果，也拓宽了这一技术的应用范围。二.CRISPR/Cas9系统简介 CRISPR/Cas9技术的产生与DNA测序技术的进步密不可分。1987年在对大肠杆菌E.coli K12的一个区段的测序结果的分析中，研究者首次发现细菌了碱性磷酸酶基因附近存在着成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR)。在接下来的十多年间，随着DNA测序技术的飞速发展，微生物基因组测序数据显著增多，更多的CRISPR在细菌和古细菌中被发现。据估计40%的细菌和90%的古细菌基因组具有CRISPR结构。CRISPR 由一系列短的高度保守的正向重复序列(repeats) 与长度相似的间隔序列(spacers)间隔排列组成(见图1)。本世纪初，CRISPR位点附近的、高度保守的Cas基因(CRISPR-associated genes)引起了研究者关注。Cas基因是一类基因家族，编码的蛋白具有与核酸结合功和核酸酶、聚合酶、解旋酶等活性。2005年，得益于病毒、质粒测序数据的日益丰富，通过对测序数据的系统分析，研究者推测间隔序列可能与外来的病毒、质粒有关。通过一系列的研究，人们认识到Cas基因可以与CRISPR序列协同作用，使细菌对病毒具有获得性免疫功能，而间隔序列则编码引导Cas蛋白定位的向导RNA的部分区段。 图2. RNA 引导Cas9与目标DNA结合并将其切割。摘自Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.?science. 2014 Nov 28;346(6213) :1258096. 三.CRISPR/Cas9技术的应用领域 对生物体包括人类自身的基因组进行高效自由地操作是许多生命科学和医学工作者的梦想。与传统的基因打靶、ZFN和TALEN等基因组操作技术相比，CRISPR/Cas9技术简单、高效，也不失精准。它已经成为基因组工程的有力工具。它在生命科学基础研究、生物技术和医药领域有广泛的应用前景。短短一两年，该技术成功应用于动植物及微生物的报道已屡见不鲜。在生物学基础研究领域，它有助于快速解析基因功能及基因间的相互作用;在生物技术领域，它有助于定向育种，有助于抗逆、高产或有特殊经济性状的作物或菌种的培育;在医药领域，利用它可以快速建立疾病模型，可以进行基因治疗和新药开发。CRISPR/Cas9的推广和应用步伐可谓一日千里。 四.CRISPR/Cas9技术与新一代测序技术的联用 革命性技术总是发展迅速、应用广泛的。作为另一项革命性的生命科学研究技术，DNA新一代测序技术在近五、六年得到快速发展和推广。它已经用于生命科学相关领域的许多方面。同样地，也可以用在CRISPR/Cas9相关的研究中。两者之间的应用领域有许多交叉或重合。 1.高通量测序可用于检验CRISPR/Cas9基因组编辑的结果，以及进行脱靶效应的分析 编码Cas9和sgRNA的片段通过质粒或其它途径转染进细胞后，Cas9在特异的位点对目标基因组进行切割，引起DNA双链断裂 (double-strand break, DSB)，通过非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)或同源重组(homologous recombination, HR)，产生DNA的插入或删除(indel)，或者依赖于含有特异突变的同源模板，进行目的位点的定向改造。基因组编辑的结果需要确认。对于目标位点或计算机预测的脱靶位点，除了用核酸酶进行电泳分析检测外，还可以用DNA测序方法确认是否有变。当需要检测的样品较少或靶位点较少时，可以采用Sanger测序。当样品或靶位点较多时，适