分子生物学实验常用工具酶概述.docVIP

现代分子生物学实验手册 工具酶 基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。 核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。 工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。 限制性内切酶（restriction endonuclease） 主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。 （这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶） 限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。 保护自身遗传物质稳定的机制。 限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。 命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号） 例： 细菌属名 细菌种名 菌株名称 限制酶名称 Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13 EcoR I Bacillus amyloliquefaciens H HamH I Haemophilus influenzae Rd Hind III （一）三种常用内切酶 I型限制性内切酶 同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。 在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。 （实际上，有内切酶、修饰酶、ATP酶及解旋酶四种功能） I型限制性内切酶在DNA链上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。没有时间应用价值。 【DNA甲基化：DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现（外遗传机制）。 多发生于CpG二核苷序列上（在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶）。 甲基化位点可随DNA的复制而遗传（DNA复制后，甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化）。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。】 III型限制性内切酶 具有内切酶和甲基化修饰酶作用。 具有专一的识别顺序，其切割位点在识别顺序旁边的几个核苷酸对的固定位置上。（可识别短的不对称序列，切割位点与识别序列约距24~26bp） II型限制性内切酶 也具有限制-修饰系统，但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行这一系统的功能。即II型限制性内切酶有在识别位点的切割功能，而不具备甲基化修饰活性，修饰作用由相应的修饰酶完成。 两种酶识别同一DNA特定序列，却发挥不同作用。 能识别双链DNA的特异顺序，并在该顺序内的固定位置上进行切割，产生特异的DNA片段。 II型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的，对相同的基因片段的切割，总是得到同样核苷酸顺序的小DNA片段。这些切割后的不同大小的DNA片段，可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他DNA片段实行连接，而构建重组DNA。——基因工程技术的核心 II型限制性内切酶识别的专一核苷酸顺序，最常见的是4~6个碱基对。 II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序（反转重复顺序），具有180°的旋转对称性。识别顺序有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方面读序都是相同的。这类酶切割DNA可有两种形式。 ①交错切割方式： 每种酶切割后个产生两个DNA片段，每一个片段个含有一个单链末端，单链末端是互补的，可以通过形成“氢键”而黏合。 不同来源的两条DNA片段经同一种酶切割后，产生互补的黏性末端，通过选择合适的DNA链接，可将两条异源性DNA片段组合在一起。 ——重组DNA的最基本原理 用选择专一性不同而产生相同黏性末端的两种酶切割两条不同的DNA片段，可使重组后的DNA片段不再被原来的酶所切割。 如：Sal I酶切割后产生的黏性末端，Xho I酶切割后产生的黏性末端，两者经连接酶连接产生的序列，既不被Sal I酶切割