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PCR反应条件
PCR反应条件 PCR的基本成分及其条件的选择 Polymerase Chain Reaction 一、PCR的基本成分 脱氧核苷三磷酸（dNTP) 标准PCR反应体系中包含4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP、和dGTP。 在常规PCR反应液中，每种dNTP的浓度一般在200～250μmol/L之间。 一价阳离子 标准的PCR缓冲液包含有50mmol/L的KCl,提高到70～100mmol/L,对改善扩增较短的DNA片段产物是有益的。 PCR反应条件为温度、时间、和循环次数 PCR反应延伸温度 总结与思考 * * 又称特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。?由美国科学家（Perkin??Elmer公司遗传部的Dr.?Mullis发明，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。 PCR包括7种基成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、dNTP、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。 模板DNA是待扩增序列的核酸 特异性引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性就取决于引物与模板DNA互补的程度。知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物。 热稳定DNA聚合酶 目前有两种TapDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶。 二价阳离子 所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常用的是mg2+ 和Mn2+ 一般来说前者优于后者。 缓冲液 要维持PCR反应体系的PH值，必须使用Tris-HCl缓冲液。标准准PCR缓冲液的浓度为10mmol/L。 PCR反应条件的选择 温度与时间的设置 循环次数 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤：变性—退火—延伸三个温度点①变性温度与时间：一般情况下，93～94℃下1min足以使模板DNA变性，过高影响酶活性，过低需延长时间。 退火温度与时间 变性后温度冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。引物的复性温度可以通过以下公式选择合适温度。Tm=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-（5～10℃） 一般选择在72℃，此时效率最高，过高不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应时间根据待扩增片段的长度而定，同时对低浓度的模板，延伸时间要长一些 *
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