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Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 内参 是检测低丰度 mRNA 的敏感方法 ,为了去除不同标本在 RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异 ,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。 内参基因通常是各种看家基因 ,在细胞内组成性表达 ,有助于保持细胞的功能。 内参基因 beta-Actin GAPDH 18SRNA 36B4 等等 PCR反应体系（96孔板—20ul） SYBP Premix Ex Taq(2 X): 10 ul PCR Forward Premer: 0.4ul PCR Referse Premer: 0.4ul ROX Reference Dye II (50 X): 0.4ul cDNA: 2.0ul H2O: 6.8ul PCR反应体系（384孔板—10ul） SYBP Premix Ex Taq(2 X): 5.0 ul PCR Forward Premer: 0.2ul PCR Referse Premer: 0.2ul ROX Reference Dye II (50 X): 0.2ul cDNA: 1.0ul H2O: 3.4ul （一）预变性： 　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： 　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 谢谢 RNA抽提、逆转录及实时荧光定量PCR 孟祥健 RNA抽提 逆转录 PCR RNA抽提 原理及方法 实验前准备工作 实验步骤 注意事项 原理及方法 TRIZOL 法（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法） TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质 实验前准备工作 试剂：氯仿、异丙醇、DEPC水、75%乙醇 （用DEPC水配制）、RNase-free的水 器材： RNase-free的枪头、移液器、酒精棉球、无尘纸 等 常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻