核酸测序技术教程范本.ppt

核酸测序技术 基因工程研究所 Sanger双脱氧链终止法 Sanger于1977年在加减法测序的基础上创建了双脱氧链末端合成终止法（chain termination method），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。 一、基本原理 利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。 双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。 在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。 产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。 二、测序反应体系的组成 （一）待测模板 1．单链模板