细菌分子鉴定.docVIP

细菌的分子鉴定 一、染色体DNA提取和纯化（细菌不同，方法略有不同） 1)4ml培养物1000rpm离心5min 2)用等体积0.85% NaCl洗涤，离心 3）用等体积TES缓冲液洗，离心 4）悬浮于0.4mlTE(pH8.0)缓冲液 5）加入50ul新鲜配制的溶菌酶液(2mg/ml in TE),悬浮于30℃处理20min，并且加入RNase，使终浓度为20ug/ml. 6)加入20ul 25%SDS和50ul 5mg/ml蛋白酶K和50ul 5M NaCl 37℃处理1h。悬液黏度增高，表明裂解。 7）加入10%体积的3M pH5.2乙酸钠溶液，轻轻混合。 8）加入等体积酚：氯仿，颠倒离心管慢慢混合15～30min，10，000rpm离心8min。 9）轻轻吸出上层（DNA很粘稠，可将tip剪成较大口），酚：氯仿抽提，直到看不见蛋白层。 10）加入等体积异丙醇沉淀DNA，可见盘曲线状物。 11）将DNA移至一小离心管中离心，用70%乙醇洗两遍；气干或真空干燥，然后用100～200ulTE缓冲液融解。 二、 PCR扩增16S rRNA基因 以227＃菌株的总DNA为模板，以F8: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和R1492: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT 10×缓冲液 2ul dNTP 2ul 引物F8 2ul 引物R1492 2ul Taq酶 0.15ul H2O 11.75ul 模板 0.1ul PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃，1min；60℃，1min；72℃，2min；循环30次； 三、 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 1）配置用于灌注电泳槽和制备凝胶所需的电泳TAE缓冲液； 2）按体积称取1%(w/v)的琼脂糖，加TAE缓冲液； 3）在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解； 4）冷却至60℃左右，加入EB溶液，使之终浓度为0.5ug/ml； 5）将溶液倒入胶膜中，插入胶疏，静置冷却； 6）待凝胶完全凝结后，小心将胶梳取出，将凝胶放入电泳槽中； 7）将样品与缓冲液(Loading Buffer)充分混合后加入样品槽； 8）接通电源，维持电压120V，直到适当时间； 9）切断电源，将凝胶于紫外灯下观察，并用紫外成像仪拍照。 四、 DNA片断的回收纯化 采用TaKaRa Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit回收纯化DNA。 1）DNA样品经琼脂糖凝胶电泳后，将目的DNA片断切出。 2）将含有DNA片断的胶块切碎后放入1.5ml的Microtube中。 3）向装有胶块的Microtube中加入约3倍凝胶量（体积比）的NaI溶液(1mg凝胶视为1ul)，55℃加热使胶块完全融化。 4）按每20ul硅胶树脂结合约1ug DNA的比例加入适量的硅胶树脂，充分混合后，于室温放置20分钟。 注）硅胶树脂使用前，一定要充分混匀。 5）离心(10,000rpm、1分钟)后除去上清液。 注）此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可废弃。如果回收率较低时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重新吸附。 6）在Microtube中加入500ul清洗液，振荡混匀后离心(10,000rpm、1分钟)，除去上清液。 7）重复操作第6步。 注）为提高DNA片断的回收效率，此时应尽量除净上清液。 8）加入和硅胶等量（体积比）的TE缓冲液或灭菌蒸馏水后混匀，55℃水浴中放置10分钟。 9）离心（10,000rpm，1分钟）后吸取上清液，注意尽量不要吸取硅胶树脂。此回收上清液即为DNA回收溶液。 注）为提高回收效率，可再重复一次第8步和第9步的操作。 五、扩增的16S rRNA基因克隆于质粒载体上 扩增的16S rDNA首先在0.8%低熔点琼脂糖胶上纯化，纯化的DNA和质粒pUCm-T Vector在16℃连接16h，然后转化入E.coli DH5α，转化子在含X-gal和氨苄青霉素的LB平板上筛选。 1连接反应 基本操作按连接酶说明书进行，外源目的DNA片断与载体DNA比例为3:1，按比例加入ddH2O，外源DNA片断，载体DNA，连接缓冲液，T4 DNA连接酶(Promega)，16℃连接16hr，用琼脂糖凝胶电泳检测连接效果。 2大肠杆菌感受态的制备和质粒的转化 （1）大量制备感受态细胞 1）从37℃培养12-16h的平板中用无菌牙签挑取一个单菌落，转到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37 2）自该