HBVDNA荧光定量PCR技术.docVIP

一、HBV DNA荧光定量PCR技术 （一） 标本 血清、血浆（其它如组织细胞、乳汁、精子、尿液等体液）；标本应封闭保存， 特别在夏季，如果标本暴露的过久，开盖保存，很容易出现水分蒸发，检测结果和上一次的检测结果会有较大的差异。 环境条件影响不大， 比如保存在 -8°、 -20°、 24°、还是室温，对高中低病毒含量的最后的检测结果影响不是太大，只要封闭保存就可以。因此 可常温运输，但不可泄露。 （二） 检测方法 国内最常使用 PEG （ 聚乙二醇方法 ）法进行核酸提取，采用 TaqMan 探针进行荧光 PCR 扩增。扩增 40 循环进行结果分析，如下图一所示： 典型的双 S 形的曲线图，越早出现荧光曲线的病毒含量越高，越晚越低。根据不同的梯度的四个标准品进行定量。如果血清或标本里面没有病毒，就是一个阴性直线。 最近我们在彻底解决污染问题之后采用扩增 50 个循环的方法。 优点是让扩增管里的反应液充分反应，缺点是如果实验室存在一个潜在的污染或操作人员操作习惯不好，很容易出现携带污染，造成假阳性。对实验室的来说不应该通过减少扩增的循环数来解决污染问题，而应该通过科学的管理，提高试剂的质量，以及养成一个良好的操作习惯，或防污染的习惯来解决假阳性的问题。增加循环数有利于标本检测结果的判断，这将来可能是实验室发展的一个趋向。 COBAS TaqMan 技术在我们国家已经有好多实验室有这种全自动的核酸提取扩增系统，它的优势重点在于检测病毒含量比较低的血清标本，但是对于病毒含量比较高的，往往出现荧光 PCR 竞争的缺点。 图一为： PCR 扩增曲线 （三）污染的预防与排除 PCR 扩增产物污染是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题，所以扩增区的仪器如枪头等要注意。最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝 , 因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。标本处理区，包括扩增摸板的制备； PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增；产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备 →PCR 扩增 → 产物分析 → 产物处理。切记 : 产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。 （四）常用仪器 常用的 PCR 仪器： ABI 系列、罗氏系列、安捷伦系列、国产 SLAN 等。 （五）临床意义 检测血清或血浆 HBV DNA 阳性有什么临床意义？ 1. 判断血清中是否有 HBV DNA 的存在 我们检测到的 HBV DNA 包括 完整 HBV 病毒和 DNA 片段。 目前我们用的 HBV DNA 荧光 PCR 法，还不能区分是完整病毒还是片段。只要检测到的病毒载量在检测线以上就可以定为标本含有 HBV DNA 。 2. 判断抗病毒疗效的评估指标 细胞内 HBV DNA 和 HBV DNA 确认方法。 病人采用各种抗病毒药物，比如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦或替米夫定等抗病毒药物，因为这些药可以有效的抑制病毒复制，用药之前或用药之后，病人的血清里或外周血白细胞里是不是还有病毒的存在？病毒下降了多少？是不是有病毒的反弹？这是临床医生关心的问题。随着抗病毒药物用药时间的延长，有些病人血清里面的 HBV DNA 一直处于检测线以下。因此目前临床医生有一些新的需求，就是能不能确认病人血清里究竟有没有 HBV DNA 。不同的实验室报告检测低限值不一样，有的实验室报 1000 IU ，有的实验室报 100 IU ， COBAS TaqMan12 个， 12 个还是有病毒，血清里究竟有多少个？是临床急需的一种 HBV DNA 确认方法。即确认血清里面究竟有没有病毒。现在已经提出一种检测方法。 3.HBV DNA 阳性与传染性 感染乙肝病毒 必须达到一定的量，突破各种屏障（ 血液里的补体、细胞因子、抗体等 ），进入肝细胞复制， 才能达到传染性的要求，因此并不是接触到病毒都会被感染 。 HBeAg 的产生与意义→ HBeAg 与 HBV DNA 清除的不平衡带来的异常模式 → HBsAg 的包裹与剪切（完整 HBV 形成） → 不同形式 HBsAg 的产生与意义。抗 HBc 、抗 HBe 和抗 HBs 的产生。四， HBV DNA 定量与乙肝血清学模式不同组合的意义。 大三阳（ 表面抗原、 E 抗原和核心抗体阳性 ）并抗 HBs 阳性： HBsAg/IgM 。 E 抗原阳性说明病