酶分子修饰和改造解析.ppt

第五节　酶的生物改造 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．定向进化的应用 一．理论来源 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 化学进化 生物进化 二．概念 随机突变+定向选择＝目标突变体 细菌 诱发突变的因素 50 0C培养 突变体库 选择压力（温度） 温度耐受型突变体 最适生长温度为370C 最适生长温度提高了！ 定向进化 属于蛋白质的非合理设计，不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 定向进化不是定点突变 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 三．定向进化的选择策略 突变 蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片消化分析 DNA shuffling 体外定向进化 四　定向进化的应用 1．提高酶分子的催化活力 L—天冬氨酸酶定向进化研究 进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。 得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶 2．提高酶分子的稳定性 T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4℃. 8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2℃ 3．提高底物的专一性和增加对新底物的催化活力 Beuve和Danchin展示腺苷酸环化酶突变后，鸟苷酸环化酶活力提高了4.5倍，但腺苷酸环化酶活力仅残留4% Zhang等利用定向进化把β-半乳糖苷酶改进成以果糖为底物的酶 4．对映体选择性的定向进化 S型选择性的转氨酶转化?-丁酮，仅有65%的手性专一性。 通过10 000个随机突变的菌株的筛选，获得10个手性专一性在80%-94%之间的酶 5．变换催化反应专一性 来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。 经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物的S型的选择性达到81% * 一般酶反应是在基本接近中性、与室温相距不大的水溶液中进行的，但在工业应用上，由于产物、底物带来的影响，作用的PH常常不在中性范围内。温度升高，酶促反应速度加快，但酶往往不稳定。若底物不溶于水，酶更难发挥作用。 Km过大，通常使反应不能在低底物浓度下高速进行。由于体内各种代谢物质的浓度较低，这种酶用于临床检测或治疗时，影响就更大。此外，有些物质，特别是有些产物对酶活性有抑制作用，天然酶的反应条件不能适应工业生产的要求。 当前应用的绝大多数酶来自动、植物细胞及微生物，对人体来说这些酶都是外源蛋白，具有抗原性，都有可能引起人体的过敏反应，不但影响临床上的连续使用，还会带来危险。另外酶进入人体后也会由于一些蛋白酶、抑制剂或抗体的作用而失去活力。 * 这包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象变得更为稳定。另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即酶的化学修饰。 * 1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 酶天然构象的稳定性是由酶分子内部基团间的相互作用、基团与水溶液间的相互作用来维持。当酶发生热失活时，酶分子内基团间的相互作用发生变化，酶从紧密 有序趋于随机松散，导致酶催化功能丧失。酶化学修饰从增强酶天然构象的稳定性入手来减少热失活。通过将酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，从而增强酶的热稳定性。 2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂 酶抑制剂是通过作用于酶活性部位来降低酶催化能力，或是直接结合于活性部位阻断酶与底物结合，或是结合于酶分子的其它部位，影响酶活性部位将底物转变成产物的反应。因此阻断抑制剂与酶结合是防止酶活性被抑制的关键。 大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电斥力能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑制剂能力增强。 3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶是蛋白，其本身也可能成为另一种酶 如蛋白水解酶 的底物，对于蛋白水解酶来说，一般是作用于某些特定敏感键后，导致蛋白多肽链断裂。对于某些酶，并不影响其活性，但对大多数酶，由于多肽链的断裂，使酶的功能结构受到了破坏而丧失了活性。 根据蛋白水解酶是一大分子物质，并且只有在充分接近多肽链上敏感键和敏感基团后才能产生作用的原理，将大分子修饰剂交联于酶上，其产生的空间障