2第二章工业微生物育种学赤峰工业职业技术学院案例.ppt

抗代谢结构类似物突变株 1 选育方法简单易行 只要能找到适当的结构类似物就很容易选育出结构类似物的抗性突变株。 主要氨基酸的结构类似物 2 生产操作方便 营养缺陷型菌株发酵要求在培养基中添加营养物质来实现，并没有从根本上解除代谢调节，向发酵罐中补充营养物质的量不易控制，所以造成生产的不稳定。而结构类似物突变株的代谢调节被遗传性地解除，生产操作更方便，产量也更稳定。 3 易于保存 抗结构类似物突变株易于保存，只要在保存的培养基中添加适量的结构类似物，就可防止回复突变的发生。 例： 黄色短杆菌的抗苏氨酸、抗赖氨酸和抗异亮氨酸的结构类似物突变株的选育。 抗结构类似物的筛选方法 第一种方法： 把结构类似物和培养基混合制成平板，把诱变后的菌体分离其上，培养一段时间后，解除反馈调节的突变株可以选择性地生长，在细胞内大量合成相对应的氨基酸，并分泌到培养基中，促使菌落周围敏感菌生长，形成一个混淆的增殖圈，挑取该菌落，进行复证。 抗结构类似物的筛选方法 第二种方法：浓度梯度法 例： 浓度梯度法用于抗异烟肼的酵母菌吡哆醇高产菌株的筛选。 4 累积前体和耐前体突变型的选育 前体物的加入对代谢终产物的合成有很大影响。特别是抗生素的前体物，对抗生素的产量的影响是直接的。 前体物对抗生素的影响 ①耐前体有关代谢物突变株的选育 ②耐前体结构类似物突变株的选育 ③耐“毒性”前体突变株的选育 ①耐前体有关代谢物突变株的选育 Kenichiro等发现添加异亮氨酸或天冬氨酸等可促进麦迪霉粟A1的生物合成，缬氨酸在低浓度时就能完全抑制麦迪霉素产生菌——吸水链霉菌的（Streptomyces hygroscopicus）的生长。 ②耐前体结构类似物突变株的选育 初级代谢产物的结构类似物的突变株的应用已比较多，次级代谢产物的结构类似物突变株的应用却比较少。不过部分氨基酸是抗生素的前体，所以通过选育一些氨基酸的结构类似物突变株来提高抗生素的产量。 例： Elander选育耐5-氟色氨酸和6-氟色氨酸突变株 出发菌株是荧光假单孢菌 生产硝吡咯菌素 此外β-内酰胺类抗生素和头孢菌素C等都是由氨基酸作为前体物合成的。 ③耐“毒性”前体突变株的选育 抗生素前体物一般有助于抗生素的生产，但当达到一定浓度时，前体物对菌株的生长有抑制作用，甚至是抑制终产物的合成。 例： 灰黄霉素生物合成的前体物质是氯化物，但高浓度对菌体生长不利。 六、解除磷酸盐调节突变株的选育 磷酸盐是菌体生长的主要制约因素，也是不可或缺的营养成分。在培养基中，只要有磷酸盐存在，菌体就处于生长状态，因此它对次生代谢产物的合成是不利的。 磷酸盐对抗生素有明显的调节作用。已报道有32种抗生素的合成都受到磷酸盐的抑制或阻遏。发生阻遏的浓度一般在10mM以上。 然而过多地限制磷酸盐的量对菌体的生长不利，也会导致抗生素产量的下降。因此在抗生素的发酵生产中要将磷酸盐的浓度控制在“亚适量”的水平。 磷酸盐对次生产物的调节机制 1 通过初级代谢的变化影响次级代谢； 2 能荷（ATP）的调节 抗磷酸盐突变株的筛选方法 Martin对抗生素合成的磷酸盐控制机制研究得比较详细，并建立了一种直观的筛选磷酸盐抑制脱敏突变株的方法。 七、细胞膜透性突变株的选育 细胞膜是细胞与外界环境进行物质和信息和交流的屏障，也是整个细胞代谢控制的重要一环。如果细胞膜通透性较差，则细胞内代谢产物难以分泌到细胞外，终产物大量积累而引起反馈抑制。 细胞膜转运物质的方式有四种 单纯扩散 促进扩散 主动运输 基团转位 影响细胞膜通透性的因素 例如：谷氨酸生产与膜透性有很大关系。 其中影响膜透性的因子很多，主要有生物素、油酸、青霉素、甘油和表面活性剂等，又以生物素影响最显著。 作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶——乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成。脂肪酸和甘油又合成细胞壁的主要成分磷脂。因此过量的生物素间接地干扰了细胞膜磷脂合成使细胞膜透性变差，谷氨酸不能排出体外。 所以，在发酵的过程中，用过量的生物素，并添加脂肪酸类似物，或添加青霉素等方法，可明显影响细菌细胞膜和细胞壁的合成，改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地外渗到培养基中。 饱和脂肪酸酯类或饱和脂肪酸的添加都可以拮抗和抑制生物素合成脂肪酸，因此油酸合成减少，由油酸和甘油共同合成的磷脂也减少，导致细菌细胞膜构成不完全，具有较好的通透性，有利于谷氨酸分泌到发酵液中。 谷氨酸细胞膜渗透性突变株的筛选方法 1 筛选抗维生素P（芦丁）的衍生物突变株； 2 筛选溶菌酶敏感突变株； 3 筛选温敏突变株。（见第七章） 1 筛选抗维生素P（芦丁）的衍生物突变株 维生素P能增加细胞膜的透性，能抗高浓度维生素P的菌株就是细胞膜透性高的生活和生产能力都很强的菌株。 可以采用浓度梯度法筛选。