9化妆品中6-甲基香豆素的检测方法-附件9.docVIP

附件9： 化妆品中6-甲基香豆素的检测方法 高效液相色谱法 1 范围 本方法规定了用高效液相色谱法测定化妆品中6-甲基香豆素的含量。 本方法适用于膏霜、乳、液、粉类化妆品中6-甲基香豆素的测定。 暂无实验数据表明本方式适用于蜡质类化妆品中6-甲基香豆素含量的测定。 方法提要 样品在经过提取后，经高效液相色谱仪分离，紫外检测器检测，根据保留时间定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。必要时，采用气相色谱-质谱（GC/MS）进行确证。本方法对6-甲基香豆素的检出限为0.00005μg，定量下限为0.00017μg。若取1g样品，本方法对6-甲基香豆素的检出浓度为0.000005%，最低定量浓度为0.000017%。 3 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯水为超纯水。 3.1 甲醇：色谱纯。 3.2 6-甲基香豆素，纯度≥99.0%。 3.3 磷酸二氢钠 3.4 磷酸二氢钠缓冲溶液[c(NaH2PO4)=0.02mol/L，pH =3.5）：称取3.12g磷酸二氢钠，加水溶解并稀释至1000mL，磷酸调pH值至3.5。 3.5 6-甲基香豆素标准储备溶液[ (6-甲基香豆素)=1.0g/L）]：精密称取6-甲基香豆素0.1000g于100 mL容量瓶中，加甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，即得标准储备溶液（浓度为1g/L）。 3.6 系列浓度6-甲基香豆素标准溶液：精密量取标准储备溶液（3.5）5ml置于50ml量瓶中，即得100μg/ mL的标准溶液，再分别精密量取0.1 mL，0.5 mL，1.0 mL，3.0 mL，5.0 mL，10 mL于100mL的量瓶中，加甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度。即得浓度分别为0.1μg/ mL、0.5μg/ mL、1.0μg/ mL、3.0μg/ mL、5.0μg/ mL、10.0μg/ mL的标准溶液。 4 仪器 4.1 高效液相色谱仪：具紫外检测器。 4.2 气相色谱-质谱仪。 4.3 分析天平：感量为0.01g。 4.4 分析天平：感量为0.00001g。 4.5 容量瓶：10mL、100mL。 4.6 具塞刻度离心试管：10mL。 4.7 涡旋振荡器。 4.8 超声波清洗仪。 4.9 离心机：转速不小于5000r/min。 5 测定步骤 5.1 样品处理 称取1.0g（精确至0.01g）样品于10mL容量瓶中，加入5mL甲醇（3.1），涡旋振荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20min，冷却至室温后，用甲醇（3.1）稀释至刻度，混匀后转移至10mL刻度离心管中，以5000r/min离心5min。上清液经0.45μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液备用。若样品中6-甲基香豆素的浓度超过了线性范围的上限，需对待测液进行适当稀释。 5.2 色谱条件 色谱柱：C18柱（ 250mm×4.6mm，5μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）； 流动相：甲醇-磷酸二氢钠缓冲溶液（3.4）； 梯度洗脱参考条件见下表：时间（min） 甲醇（%） 磷酸二氢钠缓冲溶液（%） 0 55 45 11 55 45 12 90 10 40 90 10 41 55 45 50 55 45 注：梯度洗脱条件，操作者可根据样品的不同选择最佳条件，使6-甲基香豆素与其他组分峰获得完全分离。 流速：1mL/min； 检测波长：275nm； 柱温：35℃； 进样量：10μL。 5.3 测定 按“5.2”项下色谱条件，取系列浓度的标准溶液（3.6）分别进样，进行高效液相色谱分析，以系列标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取“5.1” 项下样品溶液进样10μL，根据测定成分的峰面积，代入回归方程计算6-甲基香豆素的浓度。按“6”项下计算公式计算样品中6-甲基香豆素的含量。 6-甲基香豆素标准溶液高效液相色谱图参见附录A的图A.1。5.4 阳性结果确证 必要时，采用气相色谱-质谱确证阳性检测结果，以检查化妆品中是否有其它物质干扰6-甲基香豆素的测定。如果检出的色谱峰的保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，且所选择的离子的相对丰度比与标准物质相一致，则可判断样品中存在6-甲基香豆素。 气相色谱-质谱（GC/MS）参考条件： 色谱柱：HP-5MS 毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm，5%-苯基-甲基聚硅氧烷）或相当者； 柱温程序：初始温度100℃，保持3min，后以8℃/min 的速率升至 200℃，保持 3min； 进样口温度：250℃； 接口温度：280℃； 载气：氦气1.0 mL/min； 电离方式：EI； 电离能量：70eV； 监测方式：全扫描； 监视离子范围（m/z）：40~200； 进样方式