蛋白质相互作用研究方法解析.ppt

* * * * L/O/G/O 蛋白质相互作用研究方法在植物中的应用及分析 农学院 王涛 Contents 摘要 引言 正文 总结与展望 4 1 2 3 摘 要 植物中的各种生理活动主要是通过细胞中的蛋白质进行控制和调节的。蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。通过研究蛋白质-蛋白质的相互作用,能够更好地揭示蛋白质功能,解码生命现象。因此，探究植物中蛋白质-蛋白质相互作用研究方法，具有十分重要的意义，也是目前蛋白质研究领域的热点。本文介绍了几种蛋白质相互作用的体内（in vivo）、体外（in vitro）及生物信息学（in silico）研究方法，分析了各自的优缺点，讨论了这些研究方法在植物蛋白相互作用上的应用。侧重介绍分析蛋白相互作用网络研究方法在植物蛋白相互作用研究中的应用，以期为植物蛋白相互作用研究提供参考。 引言 目前，越来越多的高等植物基因组序列被测定出，但很多基因的功能尚不明确。基因功能的研究必将定位的蛋白质功能的研究中去，然而，蛋白质功能的发挥不是凭借单个蛋白质独立执行，而是依靠蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)执行其功能，忽略蛋白之间的结构和功能联系，很难全面了解蛋白质的功能。为更好地揭示蛋白质的功能，必然要通过蛋白相互作用研究方法来阐明植物蛋白作用的复杂网络系统。大规模的蛋白质相互作用技术对于准确理解蛋白质功能、揭开各种细胞活动的奥秘具有重大的意义，势必会引导蛋白质组学的发展进入一个全盛时期 蛋白质-蛋白质相互作用研究方法 1.体内研究方法（in vivo） （1）酵母双杂交系统(Y2H) （2）生物分子荧光互补技术（BiFC） （3）荧光共振能量转移法（FRET) 2.体外研究方法（in vitro） （1）免疫共沉淀法（co-IP） （2）GST融合蛋白pull-down技术 （3）串联亲和纯化（TAP）技术 （4）蛋白质微阵列（Protein microarrays） 3.生物信息学研究方法（in silico） 酵母双杂交系统(Y2H) 基本原理：转录因子GAL4可以分离为转录激活结构域（AD）和DNA结合结构域(BD),两种待检测蛋白分别和AD、BD融合表达,如果两者之间存在相互作用,则会使BD和AD结构域靠近，形成具有完整活性的转录因子并激活整合到酵母基因组上的报告基因转录，通过检测酵母的报告基因表达与否，可以反映两个蛋白质之间有无相互作用。 优点:简捷(可以省略蛋白质抽提纯化或抗体制备的繁琐步骤),高效能够比较容易地从cDNA文库或基因组文库中直接筛选出蛋白质之间相互作用的阳性克隆。敏感(高水平表达使得其能检测到瞬时或较弱的蛋白质相互作用),真实(接近其真实的生理状态),广泛(可以根据靶蛋白的表达部位、条件和时相的不同有针对性地采用不同组织器官细胞类型和分化期的材料构建cDNA文库) 缺陷:非普遍适用性,假阳性,假阴性,结果主要为定性数据，较少定量数据，不易精确判断蛋白质相互作用的强度和变化。 生物分子荧光互补技术（BiFC） 基本原理：将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两个片段作为标记分子，将标记分子分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合并在细胞内共表达，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。 优点:能检测到活体内蛋白质间相互作用发生的时间、位置、强弱,以及所形成蛋白质复合体的稳定性,特别适用于在生理条件下实时、直接、快速地对细胞内瞬时的、弱的蛋白质相互作用进行动态检测.可以在多种细胞内进行，不依赖外源的荧光素或显色剂等,能够直接报道蛋白质相互作用在细胞中发生的位置，追踪蛋白相互作用的动态过程，利用多彩的BiFC系统还可在1个细胞内研究多种蛋白质间的相互作用，是目前最灵敏的PPI检测方法。 缺陷:多个BiFC系统对温度敏感，融合蛋白必须为可溶性表达，表达量过高会引起非特异性。 荧光共振能量转移法（FRET) 基本原理：分别将bait蛋白、prey蛋白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和受体荧光基团(如EYFP)融合,当 bait蛋白和prey蛋白相互结合作用时,供体基团和受体基团两者之间的距离很近(约10nm),供体基团的发射光激发受体基团发射荧光。 优点:比较可靠地反映蛋白质相互作用时的距离;能检测到瞬时、较弱的蛋白质相互作用;能同时检测到两蛋白的细胞分布和作用位点。 缺陷:供体蛋白的激发光谱和受体蛋白的光谱可能存在重叠,影响实验结果;供体蛋白和受体蛋白的空间结构较大,限制了两者之间的距离,导致FRET发生效率低(约40%),且易出现假阴性;供体蛋白和受体蛋白的荧光