细胞培养(张华屏)精读.ppt

细胞培养技术 张华屏 主要内容 概述 体外培养细胞的生长和增殖特点 培养细胞所用的实验用品 常用的培养器皿及其清洗 消毒与灭菌 液体的配置（培养基，平衡缓冲液，消化液等） 细胞的处理（传代，冻存和复苏） 细胞计数及活力测定 培养物的污染及防止 第一部分 概述 细胞培养的概念 细胞培养的应用 细胞培养的基本条件 细胞培养的类型 二 培养细胞的生长和增殖过程 （一）培养细胞的生命期（Life Span of Culture Cells)，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。 （二）组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。 （一）培养细胞的生命期 培养细胞的生命期和细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况有关。 人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。 如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短。 1．原代培养期（Primary Culture） 也称初代培养，即从体内取出组织，接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。 2．传代期 初代培养细胞一经传代便改称为细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。 3．衰退期 此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。 在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）并获得恶性性（Malignancy）. （二）组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 1.潜伏期 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。细胞贴附于支持物后，除先经过延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。 2．指数增生期（Logarithmic growth Phase）： 这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。 在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。 细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞“接触抑制”和“密度抑制”是两个不同的概念，不应混淆。 3．停滞期（Stagnate Phase） 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。  三 细胞培养实验用品 超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜， 离心机 液氮罐 酸缸，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱 耗材：培养瓶，吸管，离心管，培养板， 冻存管，滤器 超净工作台 利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使