细胞培养基础大全精读.ppt

称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许或PBS溶液调成糊状，再补足PBS，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%）。 如果短期内要使用，就放置4℃冰箱。 胰蛋白酶溶液配制： 抗生素溶液 通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 一般市售市售链霉素为100万U/瓶 培养基 培养基——维持体外细胞生存和生长的溶液 1、天然培养基 2、合成培养基： 合成培养基 ：RPMI1640，DMEM等。 一般需加血清等 市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制，配制时需要补加NaHCO3，调PH。配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22μm。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 根据包装袋上的要求和实验需要补加NaHCO3和谷氨酰胺。 加抗生素： 上述溶液配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22μm。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH 四、灭活胎牛血清（FBS）与分装过程： 1、一般外购的血清只作过灭菌，在用前常需进行灭活处理。 2、热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清（加温到56℃，30min），以消除补体活性，未灭活血清应保存在–20℃冰箱。 牛血清分装： 在无菌的条件下一般分装成10ml一管，贮存于-20OC. 使用时放置4OC冰箱过夜色解冻。 细胞培养准备 一、无菌实验室 二、常用的仪器设备 三、细胞培养需要的物品 四、细胞培养用液和培养基 一、无菌实验室 组成： 更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。 缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与 几个操作间相通。 操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房 间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。 二、实验室常用设备使用 压力蒸汽消毒器 1.使用前的准备：检查进气阀及排气阀是否关闭，并加入适量水。 2.装放灭菌物：然后加盖旋紧螺旋，密封。 3.预热及排气： 4.升压保温：一般为103.43kPa，温度则相当于121.3℃时，持续15～20min即可达到灭菌目的。 5.降压开盖取物：关电源，待其压力下降至零时，方可开盖取物。 【使用方法】 干燥箱 用于细胞培养的有些器械、器皿要烘干才能使用，玻璃器皿需干热消毒，因此，细胞培养实验室均配置有电热干燥箱。干热消毒时，升温较高，一般需达到160℃。 水纯化装置 进行细胞培养时，配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水；即使用于玻璃器皿的冲洗，至少也应是二次蒸馏水。 蒸馏水器、压力蒸气消毒器和电热干燥箱都是属于大功率电器，使用时一定要注意用电安全，尽量做到分开时间使用。 超净工作台 CO2培养箱 培养箱：控温及的提供所需的CO2，使培养液的pH保持稳定。 通常使用条件为37 ℃，5％ CO2 CO2供气凋节方法 倒置显微镜 离心机 进行细胞培养时，常需要制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等，因此要使用离心机。 平衡是关键 电子分析天平 冰箱 细胞冷冻储存器 1、冻细胞和组织 2、注意液氮含量 酸度计  酶标仪 特殊设备 如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，使实验室工作做得更有效、更精确、更深入。有关的特殊或先进设备如下： 超低温冰箱，–70℃以下的冰箱便于储存有些试剂及标本； 荧光显微镜，进行荧光染色样本的观察； 更精确及快速检测细胞用的流式细胞仪等。 三、细胞培养需要的物品： 1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。 2、蓝口瓶、离心管、吸管、冻存管、烧杯、量筒、饭盒、培养皿、封口膜 3、枪头（TIP头） 4、培养板，培养皿，细胞计数板 5、手术器械。 1、清洗 2、浸酸： 玻璃器皿浸泡到清洁液中 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 63∶1000∶200 次强清洗液 120∶ 200∶1000 弱清洁液 100∶ 100∶