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* 生物氧化 河南科技大学医学院 生物化学与分子生物学教研室 【目的】 【目的】 掌握乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶及其辅酶的作用机制。 熟悉乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的辅助因子及其作用。 观察乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶在体外的不需氧脱氢作用。 【原理】 一、乳酸脱氢酶及其辅酶【原理】 乳酸脱氢酶是以NAD+为辅酶的不需氧脱氢酶。它催化乳酸脱氢转变成丙酮酸。在体内，脱下的氢先由NAD+接受，然后再经呼吸链传递给氧生成水。在体外实验中可用甲烯兰取代呼吸链中CoQ的位置为最终受氢体，使甲烯兰还原成甲烯白。试管内加石蜡油隔绝空气，以防甲烯白再被氧化。本实验中甲烯兰既是最终受氢体又是氧化还原指示剂。 为使反应向乳酸脱氢的单方向进行，实验加入KCN固定反应生成的丙酮酸。 【操作】 取小试管4支，按下表操作。 试剂(滴) 1号管 2号管 3号管 4号管 酶粗提液 － － － 10 酶蛋白制剂 10 10 － － NAD+ 制剂 － 10 10 － KCN(0.5%) 5 5 5 5 乳酸钾(1％) 10 10 10 10 甲烯兰溶液(0.02％) 3 3 3 3 蒸馏水 10 － 10 10 液体石蜡 10 10 10 10 37℃保温数分钟 【结果记录】(溶液颜色) 【结果分析讨论】 操作、结果记录、结果分析 主要试剂：酶粗提液、酶蛋白制剂、NAD+制剂 【原理】 琥珀酸脱氢酶在心、肝、肌肉中含量较多，它能催琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的2H传递给甲烯(MB)，甲烯兰还原成甲烯白(MBH2)琥珀酸脱氢酶的辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸，脱氢过程不需要O2，属于不需氧脱氢酶类。其反应式如下： 琥珀酸 →复合体Ⅱ →CoQ →复合体Ⅲ→Cyt c →复合体Ⅳ→O2 FAD (Fe-S) 二、琥珀酸脱氢酶 操作、结果记录、结果分析 【操作】 取试管两支，按下表操作： 管号 0.5％琥珀酸溶液(滴) 肝匀浆 (滴) 0.02％甲烯兰溶液(滴) 液体石蜡 (滴) 结果 1 10 15 1 5 2 10 15(煮沸) 1 5 前三种试剂加完后，再加液体石蜡，然后置38~40℃水浴中保温，观察甲烯兰的颜色变化。 【结果分析讨论】 再见 * * * * * * *