1、蛋白质化学解析.ppt

一、理化性质 6、蛋白质的颜色反应 酚试剂（福林试剂）反应 —CH2—CHCOO- +NH3 HO + 磷钨酸-钼酸 蓝色化合物 酪氨酸 一、蛋白质理化性质 7、蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝法：室温、2min、染色。 紫外吸收法：蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长出有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系。 凯氏定氮法： 一、理化性质 8、蛋白质的水解 酸、碱及蛋白质水解酶皆可破坏蛋白质的肽链使蛋白质经过一系列的中间产物，最后产生氨基酸，这些中间产物主要是蛋白胨。 蛋白质→蛋白胨→小肽→二肽→氨基酸 小结 蛋白质的相对分子质量 蛋白质的紫外吸收特性 胶体性质 蛋白质的两性电离及等电点 变性与凝固 别构作用、沉淀作用、沉降作用 蛋白质的水解 蛋白质的颜色反应：双缩脲反应、酚试剂（福林试剂）反应 二、蛋白质的分离、纯化 细胞破碎 抽 提 分 离 纯 化 鉴 定 细胞外：直接分离 细胞内 动物细胞 电动搅碎机 匀浆器 超声破碎法 植物细胞 匀浆器 石英砂研磨 微生物：溶菌酶+超声波处理 可溶性蛋白 不溶性蛋白 根据溶解度 二、蛋白质的分离、纯化 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离 盐析：由于加入大量中性盐而导致蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：蛋白质在等电点状态时颗粒之间的静电斥力最小（溶解度也最小），可使其沉淀。 低温有机溶剂沉淀法：常用可与水混溶的有机溶剂去除蛋白质的水膜，同时将pH调至pI使之沉淀。 二、蛋白质的分离、纯化 2、根据蛋白质分子量大小进行分离 透析 ：蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质与其他小分子物质分离。 超滤：利用高压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质被截留在膜上（滤膜的孔径）。 二、蛋白质的分离、纯化 2、根据蛋白质分子量大小进行分离 凝胶过滤：凝胶颗粒填装层析柱，将蛋白混合物加到柱上进行洗脱时，大分子沿着凝胶颗粒之间的空隙移动，先被洗脱出来，小分子可以进入凝胶颗粒内部后被洗脱出来，从而使各种蛋白质得以分离。常用：葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等。 二、蛋白质的分离、纯化 3、根据蛋白质带电性质进行分离 电泳：常用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可因蛋白所带电荷的差异和分子大小差异高分辨地分离或分子蛋白质。加入十二烷基磺酸钠（SDS）时，消除蛋白质所带电荷的差异，是测定蛋白质相对分子质量最常用的方法。 分子量减少 样品槽编号 二、蛋白质的分离、纯化 3、根据蛋白质带电性质进行分离 离子交换层析法：离子交换剂（阳离子和阴离子），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析住时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强，随后改变pH或离子强度可将吸附的蛋白质按被吸附力从小到大的顺序先后被洗脱下来。 2、血红蛋白的结构与功能 （2）氧合曲线 Hb + 4O2 Hb（O2）4 氧分压高（肺） 氧分压低（组织） Y = HbO2 Hb + HbO2 血氧饱和度 三、蛋白质构象与功能的关系 2、血红蛋白的结构与功能 血红蛋白的主要生理功能是运送氧。血红蛋白与氧结合是可逆的，其结合与解离主要取决于血液中的氧分压（pCO2）。 氧合血红蛋白：与氧结合的血红蛋白 脱氧血红蛋白（去氧血红蛋白）：没有与氧结合的血红蛋白 血红蛋白氧饱和度（Y）：在血液中，氧合血红蛋白分子占血红蛋白分子总数的分数或百分数 （2）氧合曲线 三、蛋白质构象与功能的关系 肌红蛋白（Mb）与血红蛋白（Hb）氧解离曲线 Hb + 4O2 Hb（O2）4 氧分压高（肺） 氧分压低（组织） 血红蛋白 肌红蛋白 3、蛋白构象疾病： 错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。 老年痴呆 疯牛病 亨汀顿舞蹈病 三、蛋白质构象与功能的关系 疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白（prion protein，PrP）引起的一种人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某些未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。 PrPc PrPsc α-螺旋 β-折叠 正常 疯牛病 正常的Prion蛋白含有大量的α螺旋 病变的Prion蛋白含有更多的β折叠 小结 决定蛋白质三维结构：一级结构、辅助因子、分子伴侣、二硫键 一级结构与生物学功能的关系 三级结构与生物学功能的关系 第五节 蛋白质的性质与分离、 分析技术 一、蛋白质性质 1、