生物技术制药重点解决方案.doc

重点（单选10个，名词解释4个，简单3个，论述2个。） 1.生物技术制药飞速发展的30年 20世纪70年代中期 生物时代（重组DNA、DNA的合成、DNA和蛋白质的微量测序技术 、重组蛋白、单克隆抗体 人胰岛素） 20世纪80年代中期 技术平台时代（新平台：高通量筛选、组合化学、胚胎干细胞技术，药物的探索性研究、治疗的新模式：反义药物、基因治疗以及在治疗中添加使用重组蛋白、胰岛素、干扰素、EPO、细胞集落刺激因子（CSF）、人生长激素等） 20世纪90年代中期 基因组时代（新技术：基因组、高通量的测序、基因芯片、生物信息、生物能源、生物光电、生物传感器、蛋白质组学和功能基因组学等 制药工程，新药研发） 2006年 后基因组时代 2.质粒三要素、基因工程制药流程、蛋白质纯化技术 质粒载体的三个要素 （1）复制子: 又称复制起始区 （2）选择标记：用于筛选鉴定 (3) 多克隆位点: 限制性内切酶识别序列 基因工程制药流程: 目的基因的制备 载体 载体与目的基因的连接 重组DNA导入宿主细胞 重组子的筛选和鉴定 细胞表达系统的选择 基因重组蛋白的分离和纯化 基因重组蛋白的主要纯化技术 1. 离子交换层析 利用蛋白质等电点的差异，通过带电的溶质分子与离子交换剂中可以交换的离子进行交换 离子交换剂 阴离子交换剂、阳离子交换剂、两性离子交换剂、选择性离子交换剂 影响因素 盐离子浓度、离子大小、洗脱梯度与流速 2. 亲和层析 利用固定化配基于目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附 酶与激活剂/受体/底物 抗体与抗原 受体与激素/配体 蛋白质与DNA/RNA结合域 亲和层析步骤： 配基固定化 亲和吸附 洗涤 洗脱解离 再生 3.凝胶过滤 4. 反相层析和疏水层析 反相层析：有机溶液洗脱，蛋白质可能变性 疏水层析：盐溶液洗脱 3.动物细胞培养常用溶液、培养基、生产用动物细胞 动物细胞培养基是维持动物组织及细胞在体外生存、生长的基本的营养物质。 1．天然培养基：直接采用取自动物体液或组织中提取的成分作培养液，如乳蛋白水解物、酪蛋白水解物、血清、血浆及胚胎浸出液等(维持液：含低浓度或不含小牛血清 /生长液：含5％～20％小牛血清 ) 2．合成培养基：化学成分主要为氨基酸、碳水化合物、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素及缓冲剂等。 (Eagle培养基含有13种氨基酸、9种维生素、6种无机盐及葡萄糖； 199培养基含21种氨基酸、17种维生素、7种无机盐、4种嘌呤、2种嘧啶、谷胱甘肽、ATP、胆固醇、吐温-80、脱氧核糖、核糖、葡萄糖及醋酸钠。 ) 3．血清培养基：不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基 无血清培养基:在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子等 3．无血清培养基(serum—free medium) 第一代 不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白 第二代 完全不用动物来源的蛋白质，蛋白质含量很低 (少于100g/ml)，使重组蛋白的纯化简单 第三代 完全不含有蛋白质或含量极低，没有任何动物、 人类蛋白或多肽 新一代 无血清、无蛋白质、无动物来源、成分确定 动物细胞培养常用的其他溶液 1．平衡盐溶液 2．培养基pH调整液 3．细胞消化液 4．抗生素溶液 1．平衡盐溶液 生理盐水 葡萄糖 维持细胞渗透压、调控培养液酸碱度平衡 酚红指示剂 pH 黄/ Hanks液 缓冲能力弱 Earle液 缓冲能力强 2．培养基pH调整液 合成培养液微酸性，需调整pH 单独配制，单独灭菌，待灭菌后的培养基使用前再加入 3.7％、5.6％、7.4％NaHCO3溶液、羟乙基哌嗪乙磺酸液 3．细胞消化液 (1)胰蛋白酶溶液： 分离自牛、猪等动物胰脏的胰蛋白酶(trypsin)呈黄白色粉末状，极易潮解，注意冷藏干燥保存.常用1:125和1:250两种浓度 (2)EDTA溶液： 一种化学螯合剂，其溶液又称Versen液，对细胞具一定的非酶性解离作用。 常用浓度0.02％(个别细胞系要求浓度较高)使用完，需用Hanks液冲洗净(血清对其无终止作用) 4．抗生素溶液 防止发生微生物污染 青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素 生产用动物细胞的种类 1．原代细胞：直接将动物组织或器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞 (需要大量的动物组织原料、不能直接从细胞库获得 、生长分裂不旺盛) 2．传代细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系 (在生物