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RNAi RNA interference 的发现 1995年，康奈尔大学的研究生Su Guo（郭苏）用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达。结果出乎意料。 1998年，卡耐基研究院Andrew Fire的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是微量双链RNA（污染）。是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰（RNA interference, RNAi） 早在1990年，Jorgensen等在研究如何增加 矮牵牛花的颜色时，观察到一种无法解释的现 象：通过添加过量色素基因拷贝来增加植物花 的着色，结果事与愿违，不但花未着色，反而 部分花变为白色。进一步的试验表明，这些导 入的基因不仅不表达，反而使植物本身的基因 表达也受到了抑制，即所谓的共抑制 （cosuppression）。 siRNA的获得 途径： siRNA的获得 体外转录 siRNA的获得 利用Dicer或RNase消化长的dsRNA siRNA的获得 依赖表达质粒在细胞内获取siRNA siRNA载体依赖RNA聚合酶Ⅲ和启动子操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达,，polⅢ可在哺乳动物细胞中表达许多的小分子RNA，并通过添加一串(3~6个)U来终止转录，该方法需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火后再克隆到载体的polⅢ启动子下游。 siRNA的获得 通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA siRNA的获得 RNAi双元表达载体 通过RCR获得目的基因,克隆后与表达载体连接。这种方法使用的表达载体有三种形式:单一启动子,它介导反向重复序列的转录进而经退火而形成;双启动子体系,就是一个基因片段从两个方向进行转录;双向启动子。 转染方法 磷酸钙共沉淀 电穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 机械法转染技术 阳离子脂质体试剂 参与RNAi反应的酶 ??Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶。Dicer酶参与RNAi反应，广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物。??结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，称为siRNA（short interference RNA），它启动了细胞内的RNAi反应。?? 细胞内存在RNAi效应的扩增系统。能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。 RNAi的反应过程 ??1.双链RNA进入细胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA； ??2.在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA； ??3.SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶降解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。 ??4.结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。 ??从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。 干扰作用的靶序列的选择选择原则?? mRNA 开放阅读框（ORF）区域作为设计双链siRNA的作用靶点；从ORF 起始密码下游75～100 碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19 个碱基序列。最理想模式是：AA-N19-TT；为了避免mRNA 调控蛋白的影响，3ˊ端和5ˊ端非编码区域不应作为作用靶点；分析获得的序列，其中GC 含量比值为45～55%之间的序列为优选；最后，在GenBank中经BLAST 全基因组扫描及序列同源性分析，以确保所选靶序列与其他基因序列没有同源性；通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，经筛选找到最有效的siRNA序列。??还需设立阴性对照，同靶序列mRNA 无同源性，但同设计好的siRNA有相同的碱基组成。 RNAi的生物学功能 防止病毒感染 抑制转座子转座 基因表达调控 RNAi的生物学功能 防止病毒感染 双链RNA是众多病毒的遗传物质，即使在被单链RNA病毒感染的细胞中，也发现了病毒特异性双链RNA。当病毒侵入生物体后可