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DNA SEQUENCINGII DNA测序流程 DNA提取 目的片段扩增 电泳分离 胶回收 DNA克隆 测序反应 Sanger双脱氧链终止法 PCR反应 反应组分 模板 引物 聚合酶 原料 dNTP, ddNTP 水 测序反应 ABI BigDye version 3.0 Kit 反应组成 模板 ？ng 引物 3.2 pmol/μl 1 μl Buffer (5×) 2 μl BigDye (2.5×) 4 μl 水 补齐至20 μl 测序反应 平衡1：BigDye vs Buffer 测序反应 测序反应 ABI BigDye version 3.0 Kit 反应组成 模板 ？ng 50ng/μl 1.5 μl 引物 3.2 pmol/μl 1 μl 1 μl Buffer (5×) 2 μl 1.5 μl BigDye (2.5×) 4 μl 1 μl 水 补齐至20 μl 10 μl 实验过程中的几个注意事项 取模板之前，应先充分混匀DNA ∵不是均一的溶液 定量操作 Takara DL2000 Marker, 5 μl电泳，每条带的亮度相当于50 ng DNA。定量时，取1 – 2 μl模板DNA上样电泳，与大小相近的Marker的条带比较亮度确定模板DNA浓度。 实验过程中的几个注意事项 测序反应中模板的用量 一般测序时，采用上下游引物双向测通。 由于定量不是特别精确，所以，建议： 对于同一模板采用多个引物测序时，各个反应中模板的用量可以稍有区别。 DNA测序流程 DNA提取 目的片段扩增 电泳分离 胶回收 产物纯化 酒精/EDTA/NaAc法 每管加入1 μl 125 mM EDTA，1 μl 3 M NaAc；（或者二者先混合再加入2 μl ） 每管加入25 μl 100% 酒精，混匀，室温避光放置15 min； 12000rpm 4℃离心30 min，马上去除酒精；注意离心管放置方向。 产物纯化 酒精/EDTA/NaAc法 每管加入70 – 100 μl 70% 酒精，混匀，12000rpm 4℃离心15 min，马上去除酒精； 重复70% 酒精洗涤1次； 洗涤1次损失50% 让残余的酒精挥发干（PCR仪 95℃ 6 min） 测序产物变性 加入10 μl Hi-Di甲酰胺， 95℃变性4 min，迅速冰冷4 min。 测序仪检测 测序仪结果 Sequencing Analysis 结果 序列分析常用软件 Sequencing analysis Chromas Bioedit Clustal W, X DNASTAR Genedoc 序列矩阵 序列应用常用软件 Paup Phylip TCS Arlequin phylogeny Phylogeny 最大简约法 MP 最大似然法 ML 贝叶斯推断 距离法 NJ, UPGMA Phylogeography NCA Population process DNA polymorphism Population differentiation Genetic diversity Effective population size …… MP Maximum parsimonious (MP) analyses were estimated using the heuristic search algorithm with 1000 replicates of random sequence addition, accelerated character transformation (ACCTRAN) optimization, tree-bisection-reconnection (TBR) branch swapping and the MULTREES options. The relative support for individual clades was evaluated by bootstrap analyses (Felsenstein 1985). Bootstrap values were calculated using 1000 replicates of heuristic searches with the same options as above with only one random addition of sequence. ML Maximum likelihood (ML) analyses were performed by using PAUP* 4.0b