2015年分子生物学实验.ppt.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 座机电话号码5 * * * 【实验结果】 提取得到的DNA应为一条带，如DNA降解会出现弥散带。 【思考题】 1.在DNA提取时，SDS、NaCl、EDTA、氯仿/异戊醇及无水乙醇各起什么作用？ 2.如何制备1％的琼脂糖凝胶？ 【实验安排】 提前两星期准备幼苗，一个下午提DNA并检测。 * * * * * * * * * * * * * 调中性，以利于细菌的生长繁殖 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 凝胶纯化结果示意图 注意事项： 切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛； 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率。 【思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？ * * 实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 【实验目的】 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和将外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术及转化体筛选的技术方法。 【实验原理】 感受态细胞 Competent cells : 受体细胞经过一些特殊方法（ 如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞 competent cell 。 * * 【实验原理】 转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 * * 【实验原理】 转化的方法： 1.化学的方法 热击法 ；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 * * 【实验原理】 克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； * * 【影响转化率的因素】 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。  * 三峡大学李晓玲编写与制作 * * * 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器 1.无菌超净台 2.离心机 3.电热恒温水浴锅 4.分光光度计 5.恒温摇床 6.恒温箱 7.超低温冰箱 （二）材料和试剂 1.菌株： E.coli DH5α（TA克隆试剂盒） 2.质粒：PUC19质粒 3.LB培养基 4.含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度 50-100μg／ml 5.预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） * * 【实验步骤】 （一）菌种活化 1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时。2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4 * * 【实验步骤】 （二）感受态大肠杆菌的制备 1.从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌 落，接种于2ml LB液体培养中，37℃振荡培 养12h左右，直至对数生长期。 2.取1.5ml菌液转接于30ml LB液体培养基中， 37℃振荡扩大培养2－3h（OD600nm≤ 0.4-0.5， 细胞数 108,此为实验成功关键）。 3. 将菌液转到30ml离心管中，冰上冷却 10min； * * 【实验步骤】 4.于4℃，4000r／min离心10min； 5. 倒净上清培养液，将管倒置10min以便培养液流尽； 6.用6ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min； 7. 0～4℃，4000r／min离心10min，回收细胞； 8. 弃上清，加1.2ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶 液，小心悬浮细胞，分装，200μl一份，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液。 9. 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。 * * （三）细胞转化 编号 组别 质粒DNA/μl TE buffer/μl 0.1mo1／L GaCl2/μl 感受态菌液 1 受体菌c