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蛋白电泳小tips 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 一．试剂制备： 1.分离胶缓冲液（pH8.9）:36.6gTris,48ml1mol/l的HCl,或先加水至80ml,用浓HCl调pH，再定容至100ml. 2.浓缩胶缓冲液（pH6.7）：5.98gTris,48ml1mol/l的HCl, 或先加水至80ml,用浓HCl调pH，再定容至100ml. 3.30%丙烯酰胺（pH≤7.0）：29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺，溶于60ml水中，加热至37ordm;C溶解，补水至100ml，用棕色瓶贮存于室温，几个月后重新配置。 4.10％过硫酸铵（W/V）：1g溶于10ml水中，4ordm;C保存数周，尽量现用现配。 5.四甲基乙二胺(TEMED) 6.10％SDS。将10gSDS溶于80ml重蒸水中并轻缓搅拌（室温低时需水浴加热溶解），再定容至100ml,室温存放。 7.样品缓冲液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巯基乙醇，0.05g溴酚兰，10g蔗糖，加水定容至100ml。 8．考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250用少量甲醇溶解后，用甲醇(40ml)-乙酸(10ml)水溶液稀释至100ml。 9．脱色液：90ml甲醇:水（1:1）和10ml冰醋酸配成100ml脱色液 10．Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱，94g甘氨酸，加入50ml10％（W/V）的电泳级SDS贮液，用去离子水补至1000ml量则成5×贮液。 二．电泳 1.用1％琼脂将长玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12％分离胶（4.9ml蒸馏水，6.0ml30％丙烯酰胺，3.8ml1.5mol/lTris-HCl,150μl10%SDS, 150μl 10%过硫酸铵, 6μl TEMED），灌到至短玻璃板4cm，用水封住，冷凝30分后将水倒出，吸干，灌满5％浓缩胶（5.5ml蒸馏水，1.3ml30％丙烯酰胺，1.0ml1.5mol/lTris-HCl,80μl10%SDS, 80μl 10%过硫酸铵, 8μl TEMED）后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子，将1×电泳缓冲液倒入电泳槽，并淹没短玻璃板 2.取30μl蛋白提取液与30μl样品缓冲液混合，于100℃水浴加热3min使蛋白变性，用微量进样器以50μl的量注入点样孔，不加样槽注入样品缓冲液。 3．以浓缩胶中100V，分离胶中180V电压进行电泳，至距底线1cm时关闭电源 4.将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染色液将凝胶完全浸泡其中，放入微波炉内，高火档照射20秒，停留1min，再照射10秒，反复几次至凝胶上色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，高火档照射20秒，倒出脱色液，再加入新鲜脱色液照射20秒，重复5－6次，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析。 ________________________________________________________ 实验室日常小技巧集锦: 平时在实验室最常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么？今天某某试验没出结果是什么原因？今天某某试验为什么会是这样的呢？” 等等。然后仔细一查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋友的一些经验，与大家分享： 1. 跑page胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。 2. 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。 3. 做WESTERN BLOT 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。 4. 有关缓冲液和培养基配置 1）将缓冲液配方中的成分分别以10－100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可 2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配LB时，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前临时翻书 5. 有关PCR主反应液配置: 在做克隆鉴定的时