院感监测计数实验.docVIP

实验十三～十四 医院感染的微生物监测及细菌计数 一、实验目的 1．掌握医院感染微生物监测常用培养基的配制。 2．掌握高压蒸汽灭菌器使用及灭菌效果的监测方法。 3．掌握空气、物表、手、使用中消毒液及无菌物品的监测方法。 4．掌握紫外线杀菌效果的监测方法。 二、实验材料 1．试剂 蛋白胨、牛肉膏（粉）、氯化钠、琼脂、蒸馏水、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、硫代硫酸钠、卵磷脂、甘氨酸、吐温-80、10% NaOH、1N HCl、4%酚红等。 2．材料 三角烧瓶、量筒、精密pH试纸、天平、高压蒸气灭菌器、无菌试管、无菌平皿、加样器、加样头、电炉、枯草杆菌黑色变种芽胞ATCC9372）等。 三、实验方法 （一）常用培养基的配制 1. 普通营养琼脂平板 配2000ml 成分：蛋白胨10g、牛肉膏（粉）5g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水 1000ml、pH7.2～7.4。上述各成份混合、溶解，校正pH。121℃ 20min灭菌后，备用。 2. 营养肉汤 配 500ml 成分：蛋白胨10g、牛肉膏（粉）5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.4。上述各成份混合、溶解，校正pH，分装每管4～5ml，121℃ 20min灭菌后，备用。 3．中和剂配制 配500ml 成份：无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g、胰蛋白胨10g、牛肉粉3g、葡萄糖2g、硫代硫酸钠5g、卵磷脂3g、甘氨酸3g、吐温-80 30ml。将各成分加入到1L蒸馏水中，待完全溶解后，加0.4%酚红4ml，调PH至7.2～7.4（淡红色），分装每管4 ml，121℃ 20min灭菌后，备用。 无菌盐水：0.9%NaCI分装每管5ml， 121℃ 20min灭菌后，备用。 （二）高压蒸汽灭菌器的使用 原理 在密闭的条件下，蒸汽不能外泄，使灭菌锅内压力增高，随之蒸汽温度也增高。高温蒸汽有很强的穿透性，热传导快，使被灭菌物品内温度迅速上升，同时含水多的环境下蛋白质较易凝固，通过凝固菌体蛋白而达到灭菌的目的。 设备构造 高压蒸汽灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水。外层坚厚，其上方有金属厚盖，锅沿旁有螺栓，借以将锅盖紧闭，使锅内气体不能外溢，因而蒸汽压力升高，从而水蒸气的温度也相应地升高。高压蒸汽灭菌器上装有排气阀计可以显示内部的蒸汽压力和温度、安全活塞以调节蒸汽。其种类有手提式、直立式、横卧式等。它们的构造及灭菌原理基本相同。 高压蒸汽灭菌锅压力与温度的关系见下表。 压力 温度（℃） Kg/cm2 磅 0.35 5 108 0.70 10 116 1.05 15 121 1.40 20 127 现在最常用的培养基灭菌条件是1.05kg／cm2 121℃ 20min，时间过长有可能破坏培养基的营养成分。含糖的生化培养基的灭菌条件是0.7kg／cm2 116℃ 15min，或用流动蒸汽法灭菌。器皿的灭菌可以1.05kg／cm2 20min。 操作方法： 1．将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝。确认已经密闭，方可进入下—步操作。 2．关闭排气阀、排水阀，打开进水阀（补足水位）。 3．打开电源，加热，使产生蒸汽。 4．当压力表指针指达 34kPa 5 磅/英寸2 ，108℃）时，打开排气阀，排出锅内冷气。 5．待锅内冷气排尽后，关闭排气阀。观察压力表升至1.05kg／cm2（121℃）时，开始记时。持续20min，至多不能超过30min，否则营养物受破坏。 7．切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。 8．待锅内压力降为零时，才可打开锅门，取出物品。 注意事项： 1．内热式高压灭菌锅，在通电前一定要补足锅内水位，否则加热时会烧毁加热管。 2．排气时，必须待锅内冷气完全排出后才可关闭排气阀加压，否则达不到灭菌效果。 3．每周必需定期用留点温度计或嗜热脂肪芽胞杆菌监测灭菌效果。 （三）蒸汽高压锅灭菌效果监测 生物监测方法：将含有5×105～5×106cfu 嗜热脂肪芽胞杆菌（ATCC7953）的溴甲酚紫蛋白胨水管分3点或5点与待灭菌物品一并放入容器内。经121℃20min灭菌后取出放入56℃～60℃温箱内培养7天，同时放一支未灭菌的指示管作阳性对照，若指示管颜色变黄或混浊即未达到灭菌效果，若培养基颜色不变或澄清则灭菌效果合格 （四）空气采样及检查方法 1．采样时间：选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。 2．采样高度：与地面垂直高度80～150cm。 3．布点方法：室内面积≤30m2，设一条对角线是取3点，即中心一点。两端各距墙1m处各一点；室内面积＞30m 2，设东、南、西、北、中5点，其中东、南、西、北点均距墙1 m。 4．采样及培养方法：用9cm直径的普通营养琼脂平板在采样点暴露5分钟