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酶的分析检测技术 酶促反应分析 酶活力测定方法 常见酶类的活力测定方法 ? 維持酵素活性緩衝液 緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子濃度，兩者都會影響酵素的活性 經常在緩衝液中加入一些物質，以增加酵素安定或保持活性 溫度的影響 濃度的影響 試劑的保存 避免潮解 分裝凍藏: 切勿反復 凍結-解凍。? 甘油凍藏 避光防菌 酵素失活的原因 可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質 變性： (2) 酵素 活性區 破壞： (3) 蛋白脢 水解： (4) 酵素 抑制劑： 酶反应速度曲线 酶反应速度和底物浓度的关系 米氏方程 v=Vmax[S]/(Km+[S]) Km为酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，为酶的特征常数。 同一酶对不同底物Km不同。 Km最小的底物为该酶的最适底物。 酶活力的测定 酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。 必须测定酶反应的初速度。 底物浓度必须足够的大，至少为Km的10倍。 酶浓度必须适合。 1、化学法 化学法是利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测定的化合物。如根据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来计算酶的活性。 2、放射性化学法 经同位素标纪的底物在酶活力测定中有很重要的价值，用于标记的同位素一般有： 当同位素衰变时放出β射线（粒子）。 放射性化学法原理与化学法相似，但反应终止后，必须把放射标记的底物与产物分离，多用层析和电泳法，然后测定产物（或底物）的放射性，就可得知酶的活性。 3、酶偶联法 有一些酶促反应的产物不易直接测定，需加入一指示酶转变成可测定的产物如测定葡萄糖氧化酶的反应速度： β—D—葡萄糖+ O2 →葡萄糖酸内酯+H2O2 此反应可用量气法或氧电极法测定，但通过一指示酶二过氧化物酶催化的反应测定吸收光谱的变化更为方便准确。 H2O2 +色原（如愈创木脂）→H20+O2+染料 测定酶活力 中止反应法或连续反应法进行 中止反应法 在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶即刻停止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量。这是最古典的但仍是经常使用的方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理，设计测定其活力的具体方法。 酶反应的中止 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性等。酶反应的底物或产物一般可用化学法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。 三、连续法测定酶活力 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。 1、一般的连续法 A 光谱吸收法 该法主要指分光光度法和荧光法。分光光度法是利用反应物和产物在紫外和可见光部分光吸收不同，选择一适当的浓度，连续测定读出反应过程中光吸收的变化。该法适用于一些反应速度较快的酶。自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们接受。 脱氢酶以NAD+或NADP+或作为辅酶，反应中形成NADH或NADPH，340nm处可以观察到光吸收的变化。 NAD（P）H在340nm处吸收光后发射出460nm的光。因而，需这两个辅因子的任何反应都可用荧光法测定。 B 电化学法 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中，最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参与反应的酶的活力。 C 量气法 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通过测量反应系统中气相的体积或压力的改变，计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的气体测量仪为瓦（勃）氏测压仪（Warburg manometric apparatus）。用测压仪测定酶活力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较光谱吸收法低。 D 量热法 由于在反应过程中有反应热的变化，用非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度。该法灵敏，无干扰，且很通用，近年来逐渐引起了人们的重视。 E 旋光法 在某些酶催化的反应中，底物和产物的旋光有所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶反应过程。在某些情况下，可通过形成络合物来提高旋光度。如乳酸与钼酸盐反应形成高比旋络合物，故可用旋光计跟踪LDH催化的乳酸和丙酸之间的转换。然而，在通常情况下，由于该法与其它方法相比灵敏度低，因而很少采用 2、偶联的连续法 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联