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核酸检测在血液筛查中的应用 　深圳市血液中心 血液筛查是否需要进行核酸检测 无偿献血的新动态 “定期无偿献血者是低危的献血者”，但是“以体检为目的定期无偿献血者是高危献血者”而且这部分人群的献血队伍正在扩大。这部分人群窗口期的机率高于其他人群。因为在他们中间高危的传播行为经常发生。 经过治疗后的HBsAg转阴，ELISA方法检测阴性的献血者。 NAT与ELISA互补 病毒变异 免疫静默期 实验操作失误 病毒感染的窗口期 病毒检测窗口期 血筛用NAT试剂与临床用的不同 目的和要求不同 定性与定量 临床使用核酸检测主要目的是定量监测，进行疗效分析。 血筛用于病原体的定性筛查 灵敏度和特异性 临床在漏检与误差之间更重视误差 血液筛查用核酸目的是保证用血安全，更重视漏检 质控要求不同 临床用与血液筛查用质控要求也不同。临床试剂以定量准确和防止误报为质控目标 血筛用以防止漏检为主要目的 阳性率也不同 临床更多的阳性；血筛更多是阴性 对自动化要求不同 临床更多用于病人,单人份检测,标本量少 血筛更多用于正常人，因此检测量不同，对自动化的要求也不同 血筛用NAT平台的要求 灵敏度 HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml 特异性 核酸的特异性高，几乎没有方法学假阳性 但要防止污染 内标（内对照） 为避免假阴性，要求每管阳性质控 自动化 大规模、高通量 关于灵敏度的几个问题 厂家宣传的灵敏度均指单人份检测，而非推荐pooling方案的实测灵敏度 实际应用灵敏度=宣传灵敏度×pooling数 IU才有可比性：WHO标准品以及国家一级标准品均以IU为单位 HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。 美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被检出 HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏度要求高 低于灵敏度也有检出的可能，这与取样几率有关 血液筛查常用的NAT技术 核酸提取均使用磁珠法 磁珠提取的原理： 将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附核酸，并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中提取出来 步骤： 裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱 优点： 磁珠提取特异性高，受标本因素影响小，灵敏度高 易于实现自动化 缺点： 成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动)。完全手工工作量太大 实时荧光定量?PCR技术原理 所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 。  实时荧光优点 特异性好 引物、探针双重保证特异性 方法学假阳性很少 扩增检测同时进行，速度快，且不对扩增产物进行处理，不易污染 荧光检测灵敏度高 罗氏第二代的NAT试剂也是使用实时荧光检测 内标设计原理 内标为一已知低含量的与模板扩增效率相似的一段DNA片段，将它加入PCR反应液中，与模板共同扩增，以反应每管真实的扩增情况，如果内标和样品都未扩增出结果，则表示该管扩增无效，应重新做。 内标的作用：避免假阴性 内标的种类： 同源、异源 内标的作用： 真实反应扩增效率 避免假阴性：假阴性是目前血液筛查中最重视的问题之一，内标全程进行质量监控质控 核酸检测中遇到的问题与解决方案 人员素质和清洁很重要 血筛用NAT对低浓度要求太高，高灵敏度的试剂操作对人员要求高，同样的平台不同的实验员有很大的差距。 平台建立初期会有较大问题 对人员素质要求与自动化程度成反比 实验室及仪器清洁很重要 由于少有高浓度标本，因此大面积的污染不易发生。但由于试剂灵敏度高，如不随时注意清洁，污染有积累效应，会出现散发性样本污染，引起假阳性 采血样管的处理 玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活。 标本汇集 利用STAR工作平台,编制汇集软件。 合理的Pooling方案 Pooling方案 灵敏度因素 检出血液中最低的病毒含量与标本汇集数量呈正比 成本因素 试剂价格以test为单位，检测单位成本与pooling方案有关 检测标本量及检测时间因素 扩增检测量=提取量×3(HBV、HIV、HCV) 与仪器密切相关 影响灵敏度因素 Pooling方案 内标的浓度 标本的加样量 磁珠的量和混匀 模板制作过程的损失和提取量 批质控的